微生物發酵飼料對奶牛瘤胃發酵功能及飼糧營養物質體外消化率的影響

徐子萱 李冬芳 于春微 李松建 高 民 胡紅蓮 劉大程*

(1.內蒙古農業大學獸醫學院，呼和浩特010018；2.農業部動物疾病臨床診療技術重點實驗室，呼和浩特010018；3.內蒙古農牧業科學院動物營養研究所，呼和浩特010031)

反芻動物獨特的瘤胃發酵系統能夠分解飼料中的營養物質并合成自身所需的營養，如菌體蛋白(BCP)、揮發性脂肪酸(VFA)等。微生物發酵飼料是以植物性農副產品為主要原料，通過微生物的代謝作用，降解部分多糖、蛋白質和脂肪等大分子物質，生成有機酸和可溶性小肽等小分子物質，其營養豐富、適口性好、活菌數量高[1]。大量研究表明，微生物發酵飼料可有效減少棉籽粕等原料的抗營養因子含量，還能產生如活性肽、多糖、有機酸等活性物質[2]，這類物質能增強機體的免疫功能[3-4]，提高抗氧化功能[5-6]，改善動物的腸道微生態平衡[7]，同時可提高動物采食量和飼料利用率[8]。微生物發酵飼料的菌種與制備工藝不同，作用效果有很大差異，本課題組前期研究的一種微生物類發酵制劑，由高活性酵母菌和枯草芽孢桿菌經發酵而成，其主效成分包括甘露聚糖、葡聚糖、氨基酸、多肽和有機酸5種營養活性物質[9]，能為瘤胃微生物生長提供特殊的營養底物，刺激瘤胃微生物的生長，調控瘤胃功能。實際生產中盲目飼喂微生物發酵飼料的現象也較為常見，缺乏配套的使用技術，效果不佳還會增加養殖成本[10]。目前，不同添加水平微生物發酵飼料對體外瘤胃發酵的影響鮮見報道。因此，本研究通過體外發酵試驗評價不同添加水平微生物發酵飼料對奶牛的瘤胃發酵功能及飼糧營養物質體外消化率的影響，為今后微生物發酵飼料在奶牛養殖中的應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 微生物發酵飼料

以麩皮、米糠、棉籽粕、玉米皮等9種農副產品為主要發酵原料，將課題組菌種庫的釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae，SC)2株，編號分別為XR4和BC；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)1株，編號為A15，以XR4∶BC∶A15按菌液體積2∶2∶1混合，8%接種量接入250 kg的固態發酵飼料中，加水使最終含水量為45%，于車間中30 ℃好氧堆積發酵48 h。根據本課題組前期成果[11-12]，其主效指標為：酵母菌數量≥5×108CFU/g，β-葡聚糖含量≥5.484 g/kg，甘露聚糖含量≥3.438 mg/kg，多肽含量≥1.36 mg/g，有機酸含量≥1.48 mg/g。

1.2 試驗動物與飼養管理

選擇5頭體態狀況較好、體重相近，帶有永久瘤胃瘺管的奶牛，單欄飼養，自由飲水。飼糧營養水平參照NRC(2001)奶牛飼養標準，基礎飼糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(干物質基礎)

1.3 試驗設計

體外發酵試驗中，將玉米秸青貯、羊草、苜蓿干草3種粗料與玉米、豆粕2種精料配成精粗比為5∶5的全混合日糧作為培養底物，對照組全混合日糧中添加奶牛濃縮料(粗蛋白質34.60%、鈣2.05%、磷1.40%、食鹽1.20%、賴氨酸1.44%、蛋氨酸0.59%)，4個試驗組全混合日糧中分別添加3%、5%、7%和9%微生物發酵飼料。全混合日糧組成及營養水平見表2。

1.4 試驗方法

體外發酵裝置：恒溫水浴搖床。培養管為100 mL的玻璃注射器，針頭的上端連接三通閥橡膠管，試驗過程中三通閥關閉以確保嚴格的厭氧環境。涂抹凡士林在注射器活塞的四周，防止漏氣，還能使活塞向上移動的阻力減小。

瘤胃液采集和人工瘤胃培養液配制：在晨飼前采集奶牛瘤胃液，裝入保溫瓶迅速返回實驗室，緩慢通入二氧化碳(CO2)條件下，瘤胃液4層紗布過濾待用。人工瘤胃培養液參照Menke等[13]的方法進行配制。

體外人工瘤胃接種：0.2 g樣品放入培養管，加人工瘤胃培養液(瘤胃液∶培養液=1∶2)30 mL，推出氣泡。樣品做5個平行，無培養底物的瘤胃液作5個空白對照。記錄初始的刻度，放置于搖床中39 ℃條件下培養24 h。再稱取0.2 g發酵底物放入150 mL廣口培養瓶中，向培養瓶中加入120 mL培養液，持續通入CO2；蓋上帶有氣閥的橡皮塞；放入39 ℃恒溫水浴搖床中培養，用于測定干物質體外消化率(IVDMD)。

分別在培養0、3、6、9、12、24 h時取樣，對培養液的產氣量、pH及氨態氮(NH3-N)、VFA、BCP濃度進行測定。

1.5 測定指標及方法

瘤胃發酵參數測定：產氣量在發酵管上直接讀取刻數進行記錄；pH采用pHs-3c型高精度酸度計(梅特勒-托利多公司)進行測定；VFA濃度按秦為琳[14]的方法通過Varian氣相色譜儀(GC-450，德國)進行測定；NH3-N濃度按馮宗慈等[15]的比色法，使用T6系列紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)進行測定；BCP濃度采用考馬斯亮藍比色法，使用T6系列紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)進行測定[16]。

表2 全混合日糧組成及營養水平(干物質基礎)

體外24 h培養結束后，培養液用尼龍袋(尺寸為110 mm×80 mm，孔徑為400目)過濾，殘渣105 ℃烘干后，稱重并計算樣品IVDMD。對消化后樣品中的粗蛋白質(CP)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量進行測定，CP含量采用全自動凱氏定氮儀(K9860，濟南海能儀器有限公司)進行測定，NDF、ADF含量采用濾袋法(ANKOM A200i型半自動纖維分析儀，美國Ankom公司)進行測定[17]，并按公式計算粗蛋白質體外消化率(IVCPD)、中性洗滌纖維體外消化率(IVNDFD)、酸性洗滌纖維體外消化率(IVADFD)：

營養物質體外消化率(%)=100×{[樣品重(%)×
樣品中該營養物質含量(%)]-[殘渣重(%)×
殘渣中該營養物質含量(%)]}/[樣
品重(%)×樣品中該營養物質含量(%)]。

1.6 數據處理與統計分析

在Excel 2010中對數據進行處理，制作圖表；使用SAS 9.0軟件中的GLM過程對數據進行方差分析；用DPS 14.0數據處理系統中Topsis法對數據進行綜合評價。

2 結 果

2.1 不同添加水平微生物發酵飼料對培養液產氣量的影響

由表3可知，隨著體外培養時間的延長，培養液產氣量逐漸升高。在培養3、6 h時，5%、7%和9%組的產氣量顯著高于對照組(P<0.05)；在培養9 h時，7%組的產氣量顯著高于對照組(P<0.05)，在培養12和24 h時，7%和9%組的產氣量顯著高于對照組(P<0.05)。7%組的產氣量平均值最高，顯著高于對照組和3%組(P<0.05)。

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2.2 不同添加水平微生物發酵飼料對培養液pH的影響

由表4可知，隨著體外培養時間的延長，培養液pH逐漸降低。在培養0、3、6、9 h時，各組的pH無顯著差異(P>0.05)；在培養12 h時，9%組的pH顯著高于3%組(P<0.05)，但與其他各組無顯著差異(P>0.05)；在培養24 h時，7%組的pH最低且顯著低于對照組(P<0.05)。3%組的pH平均值顯著低于對照組和9%組(P<0.05)。

2.3 不同添加水平微生物發酵飼料對培養液總揮發性脂肪酸(TVFA)濃度的影響

由表5可知，隨著體外培養時間的延長，培養液TVFA含量逐漸增加。在培養3 h時，7%組的TVFA濃度顯著高于對照組和3%組(P<0.05)；在培養9 h時，5%、7%和9%組的TVFA濃度顯著高于對照組(P<0.05)；在培養24 h時，3%、5%、7%和9%組的TVFA濃度均顯著高于對照組(P<0.05)，且以7%組最高。7%組的TVFA濃度平均值最高，顯著高于對照組和3%組(P<0.05)。

表3 不同添加水平微生物發酵飼料對培養液產氣量的影響

表4 不同添加水平微生物發酵飼料對培養液pH的影響

表5 不同添加水平微生物發酵飼料對培養液TVFA濃度的影響

2.4 不同添加水平微生物發酵飼料對培養液乙酸、丙酸、丁酸濃度及乙酸/丙酸的影響

由表6可知，在培養0、3、6、12 h時，各組乙酸濃度無顯著差異(P>0.05)；在培養9 h時，7%組的乙酸濃度顯著高于對照組和3%組(P<0.05)；在培養24 h時，7%組的乙酸濃度顯著高于對照組(P<0.05)。7%組的乙酸濃度平均值最高，顯著高于對照組和3%組(P<0.05)。

在培養0、3、6、9、12 h時，各組丙酸濃度無顯著差異(P>0.05)；在培養24 h時，3%、5%、7%和9%組的丙酸濃度顯著高于對照組(P<0.05)。7%組的丙酸濃度平均值最高，顯著高于對照組(P<0.05)。

在培養0 h時，對照組的丁酸濃度顯著高于3%、9%組(P<0.05)；在培養3 h時，7%組的丁酸濃度顯著高于3%、5%組(P<0.05)；在培養9 h時，7%組的丁酸濃度顯著高于對照組(P<0.05)，但與其他各組差異不顯著(P>0.05)。7%組的丁酸濃度平均值最高，顯著高于對照組(P<0.05)。

表6 不同添加水平微生物發酵飼料對培養液乙酸、丙酸、丁酸濃度及乙酸/丙酸的影響

2.5 不同添加水平微生物發酵飼料對培養液NH3-N濃度的影響

由表7可知，隨著體外培養時間的延長，培養液NH3-N濃度在培養0、3 h時下降，之后又逐漸上升，在培養12 h時達到最高值又大幅度下降。在培養0、3、6h時，各組NH3-N濃度無顯著差異(P>0.05)；在培養9 h時，3%、5%、7%組的NH3-N濃度都顯著高于對照組(P<0.05)；在培養12、24 h時，各組NH3-N濃度無顯著差異(P>0.05)。7%組的NH3-N濃度平均值最高，顯著高于對照組(P<0.05)。

表7 不同添加水平微生物發酵飼料對培養液NH3-N濃度的影響

2.6 不同添加水平微生物發酵飼料對培養液BCP濃度的影響

由表8可知，隨著體外培養時間的延長，培養液BCP濃度在培養0、3 h時呈增加的趨勢，在培養6 h時逐漸下降，在培養9、12 h時逐漸升高趨勢，在培養24 h時BCP濃度最高。在培養0、3、6 h時，各組BCP濃度無顯著差異(P>0.05)；在培養9、12、24 h時，5%、7%組的BCP濃度顯著高于對照組(P<0.05)。7%組的BCP濃度平均值最高，顯著高于對照組及3%、9%組(P<0.05)。

表8 不同添加水平微生物發酵飼料對培養液BCP濃度的影響

2.7 Topsis綜合分析結果

由表9可知，使用DPS軟件Topsis法對多試驗和多指標綜合分析，微生物發酵飼料適宜添加水平為7%。

2.8 微生物發酵飼料對飼糧營養物質體外消化率的影響

按7%的微生物發酵飼料適宜添加水平，采用一級離體消化試驗來測定飼糧營養物質體外消化率。由表10可知，試驗組的IVDMD、IVCPD、IVNDFD、IVADFD均高于對照組，分別比對照組提高了0.80%、1.43%、3.76%和1.98%(P>0.05)。

表9 各瘤胃發酵參數Topsis綜合分析結果

表10 微生物發酵飼料對飼糧營養物質體外消化率的影響

3 討 論

3.1 不同添加水平微生物發酵飼料對培養液產氣量的影響

產氣量可反映瘤胃微生物對發酵底物的利用能力，通過試驗中產氣量的測定，能估測出培養底物的消化水平、消化速率[18-21]。本試驗結果顯示，在培養3、6 h時，5%、7%和9%組的產氣量顯著高于對照組；在培養12、24 h時，7%和9%組的產氣量顯著高于對照組。本課題組使用高活性的3株菌株和特殊工藝的發酵飼料，其中含有大量活性物質，如β-葡聚糖、甘露聚糖、有機酸、多肽等，微生物發酵飼料的添加水平增加，進入培養液中的有機酸、多肽等營養活性物質含量也隨之增多，能有效提高瘤胃微生物的活性[22]，從而增加了培養液的產氣量。

3.2 不同添加水平微生物發酵飼料對培養液VFA濃度的影響

瘤胃在發酵的過程中可以產生的大量VFA，供給動物機體70%左右的能量[23]。多項研究證實，瘤胃內進行乙酸和丙酸發酵，乙酸參與了三羧酸循環，進行氧化供能或用于脂肪酸合成，丙酸是糖異生的前體物質，也是反芻動物所需葡萄糖的主要來源[24]。本試驗中，7%組的乙酸濃度高于對照組，各組TVFA濃度均逐漸升高，說明微生物發酵飼料能夠加強瘤胃的發酵功能，促進了底物的發酵，產生更多的VFA。在發酵9、24 h時，5%、7%、9%組的TVFA濃度顯著高于對照組。培養24 h時與培養0 h相比，各組乙酸/丙酸均降低，說明添加微生物發酵飼料能改變瘤胃的發酵類型，使其趨于丙酸發酵型，從而提高了瘤胃發酵的能量利用率。

3.3 不同添加水平微生物發酵飼料對培養液NH3-N和BCP濃度的影響

微生物發酵飼料中的氮被瘤胃內的微生物分解，最終轉化成為NH3-N和BCP。BCP合成效率為有機物用于合成微生物的效率[25]，所以瘤胃內合適的NH3-N濃度更有利于BCP合成效率的最大化，又可以防止氮浪費。本試驗中，在培養6、9、12 h時，NH3-N和BCP濃度在逐漸增加，表明此時間段微生物發酵飼料能夠使飼料利用率增加，還可以使飼糧中的氮被瘤胃內的微生物逐漸分解，微生物發酵飼料也使瘤胃微生物利用NH3-N合成BCP的能力有所提高。3%、5%、7%和9%組培養液中NH3-N和BCP濃度平均值均高于對照組，表明添加微生物發酵飼料既能使飼糧中氮轉化為NH3-N的效率提高，又能為合成BCP提供充足底物，促進了瘤胃內BCP的合成。

3.4 微生物發酵飼料對營養物質體外消化率的影響

干物質、CP、NDF、ADF等降解率的大小是飼糧中衡量質量的重要指標，數值越高表明飼糧在瘤胃中的降解程度越高[26]。因此，飼糧在瘤胃內的降解能力可以客觀的表明微生物發酵飼料的作用效果和作用方式。本試驗中，添加7%微生物發酵飼料后，試驗組的IVDMD、IVCPD、IVNDFD、IVADFD均高于對照組，這說明微生物發酵飼料能夠刺激瘤胃微生物更好地發酵底物，提高了飼糧中的氮轉化為NH3-N等物質的效率，合成了大量的BCP，與植物蛋白質相比，BCP更容易被機體消化利用。

4 結 論

飼糧添加7%微生物發酵飼料可提高瘤胃發酵功能，提高飼糧營養物質體外消化率。