慢性熱應激期營養調控對放牧妊娠牛生殖激素含量、免疫功能及抗氧化能力的作用

武思同 敖日格樂* 王純潔 斯木吉德 陳 浩 張 晨 曹家銘 徐 萍 劉飛鴻

(1.內蒙古農業大學動物科學學院，呼和浩特010018；2.內蒙古農業大學獸醫學院，呼和浩特010018)

動物應激一直是制約我國畜牧產業發展的重要因素之一，許多因素可以導致動物應激。根據應激源的不同分為熱應激、冷應激、束縛應激、運輸應激等[1]。由高溫刺激引起的熱應激根據應激持續時間可分為急性熱應激和慢性熱應激。根據畜牧養殖業的實際情況，家畜熱應激主要是由于季節變化導致飼養環境溫度高于最適體溫引起的，并且都有較長的持續時間，屬慢性熱應激。近些年來，隨著全球氣溫普遍升高，氣候變化導致的動物熱應激逐漸威脅著世界生態系統和畜牧生產系統的可持續性[2]。熱應激可引起畜禽體溫調節及生理機能紊亂等一系列異常反應，甚至死亡[3]。國外幾項研究報告表明，夏季高溫會導致母牛妊娠率顯著下降[4-5]。我國也有許多研究證實，熱應激可以導致母畜繁殖性能下降[6-7]。生產性能和繁殖性能的提高是畜牧業可持續發展的重要前提。因此，熱應激限制了我國畜牧業的發展，造成了巨大經濟損失。Silanikove等[8]預測，由于全球變暖的進展，在不久的將來動物熱應激問題會日益嚴峻。在我國肉牛養殖產業中，繁殖母牛的健康狀況是影響肉牛業經濟效益的最重要因素。有研究表明，奶牛處于熱應激狀態時采食量降低，生產性能下降[9]。熱應激會引起母牛體內激素分泌失調、代謝紊亂以及胚胎早死等疾病，還會影響母牛的受胎率及流產率增加、新生犢牛死亡率增加[10]。而我國內蒙古地區多以粗放的飼養模式為主，夏季草原沒有舍飼降溫防控熱應激的條件，這導致了放牧牲畜長時間處于慢性熱應激的狀態。國外有研究表明，增強營養干預可能會改善熱應激期間動物的耐受性和生產性能[11-12]。因此，通過營養調控手段緩解熱應激對草原放牧牲畜造成的負面影響是目前最有效的方式之一。而國內對熱應激放牧牛營養調控方面缺乏相關的試驗數據，為了更好地指導放牧肉牛產業的健康發展，本試驗選用妊娠5個月左右的西門塔爾牛，研究熱應激放牧妊娠牛營養調控對其生殖激素含量、免疫功能及抗氧化能力的影響，旨在為我國放牧的飼養模式下肉牛養殖業緩解熱應激提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

本試驗于2019年7月在內蒙古赤峰市阿魯科爾沁巴彥溫都爾草原進行。該地區是科爾沁草原和錫林郭勒草原的交錯地帶，牲畜資源豐富，且有天然河流經過，便于牲畜自由飲水，適合開展試驗研究。

1.2 試驗設計及飼糧

試驗隨機選擇妊娠5個月左右、健康、體重和體況相近的西門塔爾母牛18頭，隨機分為對照組(僅放牧)和試驗組(營養調控)，每組9頭。天然牧場沒有遮陰樹木或人工遮陰棚等避暑措施，有天然河流經過，放牧試驗牛全天自由采食牧草和自由飲水。試驗開始前采集試驗地草場的牧草樣本，用概略養分分析法測定牧草養分，放牧草場牧草概略養分見表1。根據我國《肉牛飼養標準》(NY/T 815—2004)，在試驗地牧草營養成分以及采食量的基礎上，精準調配補飼料進行營養調控，補飼精料的組成及營養水平見表2。對照組全天放牧不進行補飼，試驗組每天歸牧后進行補充飼喂精料，每頭2.5 kg/d。預試期10 d，試驗期60 d。

表1 放牧草場牧草概略養分(干物質基礎)

表2 補充精料的組成及營養水平(干物質基礎)

1.3 放牧妊娠牛干物質采食量(DMI)的測定

采用內外源指示劑結合法測定放牧牛的DMI，選取體況相近的放牧妊娠牛5頭，每天08:30和18:30以膠囊形式喂服三氧化二鉻(Cr2O3)各1次，每頭牛每次12 g。預試期3 d，正試期7 d。正試期每天定時采集糞便200 g，將每頭牛每天的糞樣混合均勻陰干保存，用以測定糞中的Cr2O3含量，采用72-1分光光度計比色法測定[13]。采用人工模擬采樣法采集牧草，現場跟群觀察放牧牛采食牧草的種類和部位，連續7 d每天采集牧草2 000 g，混勻，保存于-20 ℃冰箱備用。牧草、糞樣中的鹽酸不溶灰分(AIA)含量采用4 mol/L AIA法測定。根據放牧牛采食牧草中干物質AIA含量、糞樣中干物質含量及糞中干物質AIA含量按以下公式計算出放牧牛DMI:

DMI=F×a/b。

式中：DMI為干物質采食量；F為糞樣中干物質含量；a為糞中干物質AIA含量；b為采食牧草中干物質AIA含量。

1.4 牧草和精料營養成分的測定

牧草和精料營養成分的測定指標包括干物質、粗蛋白質、粗灰分、粗纖維、粗脂肪含量和綜合凈能，參照陳浩等[15]的方法進行測定。

1.5 環境溫濕度的測定

由于試驗是以在天然草場進行全年放牧的肉牛為研究對象，因此所測的環境指標均為自然環境下的溫度和相對濕度。試驗期間，記錄草場溫度和相對濕度，統計每天最高氣溫和最低氣溫并計算平均溫度，環境溫濕度指數(THI)的計算方法公式如下：

THI=(1.8×Td+32)-(0.55-0.55×RH×
0.01)×(1.8×Tw-26)。

式中：Td為干球溫度(℃)；RH為相對濕度；Tw為濕球溫度(℃)。

1.6 樣品采集

分別于試驗期第1、30和60天早晨空腹進行頸靜脈采血，每頭牛10 mL，血樣靜置0.5 h后，用離心機999×g離心15 min，收集血清于離心管中，記錄相關日期及編號后液氮儲存，將樣品送至實驗室保存至超低溫冰箱中，以待檢驗。

1.7 測定指標

血清激素：三碘甲狀腺原氨酸(T3)、催乳素(PRL)、促卵泡素(FSH)、孕酮(PROG)、雌二醇(E2)含量。

免疫指標：免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-4(IL-4)含量及溶菌酶(LZ)活性。

抗氧化指標：超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)。

以上指標均采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)法進行測定，利用GYI-LRH-400-D生化培養箱和BIO-RAD680型酶標儀檢測上述指標，檢測所需ELISA試劑盒購于江蘇酶免實業有限公司，試驗操作步驟詳見試劑盒說明書。

1.8 數據處理

用Excel 2016整理試驗數據，采用SPSS 9.0軟件對數據進行統計分析。2組間數據比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組內組間(第1、30和60天間)數據比較采用獨立樣本t檢驗。結果以平均值±標準差表示，以P<0.05為差異顯著性水平。

2 結 果

2.1 熱應激與環境溫度情況

熱應激的程度分為：輕度熱應激(7288)。表3為3次采樣當天和整個試驗期的平均溫濕度及THI指數的測定情況。圖1所示為試驗期間牧場THI變化趨勢，結果顯示在整個60 d的試驗期間，有41 d處于輕度熱應激狀態，有3 d處于中度熱應激狀態。這表明草原放牧的試驗牛群長期處于熱應激環境。圖2為試驗期間牧場環境溫度的變化趨勢，結果顯示夏季放牧草場晝夜溫差大，試驗期間最高氣溫41.2 ℃，夜間最低氣溫10.2 ℃，日最大溫差可達到25.5 ℃。這表明放牧肉牛不僅受到高溫熱應激的侵害，還處于氣溫日較差大的惡劣環境中。

2.2 營養調控對慢性熱應激期放牧妊娠牛血清生殖激素含量的影響

由表4可知，在試驗第60天，試驗組妊娠牛血清PROG含量顯著高于對照組(P<0.05)，同時試驗組妊娠牛血清E2含量顯著高于對照組(P<0.05)。而在整個試驗期間，試驗組組內組間妊娠牛血清PRL含量增加顯著(P<0.05)，試驗第60天顯著高于第1天(P<0.05)。試驗組妊娠牛血清T3含量隨著試驗的進行有了顯著的提高，在試驗第60天顯著高于第1天(P<0.05)。2組妊娠牛血清FSH含量在組內組間無顯著差異(P>0.05)。

表3 試驗期天然草場平均溫濕度及溫濕指數

圖1 試驗期間天然牧場溫濕度指數折線圖

圖2 試驗期間天然牧場溫度折線圖

表4 營養調控對慢性熱應激放牧妊娠牛血清生殖激素含量的影響

續表4項目Items時間Time試驗組Experiment group對照組Control groupP值P-value 促卵泡素 FSH/(mIU/mL)第1天 Day 15.93±0.965.57±0.710.623 1 第30天 Day 306.21±1.005.68±0.540.427 8 第60天 Day 605.89±1.765.18±0.250.525 0 孕酮 PROG/(ng/mL)第1天 Day 118.01±4.2115.27±2.860.403 7 第30天 Day 3020.71±3.1517.92±3.740.380 5 第60天 Day 6025.42±3.34a18.21±2.13b0.034 5 雌二醇 E2/(pg/mL)第1天 Day 146.16±2.5946.29±3.950.963 1 第30天 Day 3047.61±4.5942.12±6.660.304 9 第60天 Day 6053.06±2.55a44.41±1.63b0.007 8 三碘甲狀腺原氨酸 T3/(nmol/L)第1天 Day 16.19±0.72B5.71±0.370.359 8 第30天 Day 306.96±0.747.10±0.850.834 6 第60天 Day 608.58±1.06A7.42±0.800.203 6

2.3 營養調控對慢性熱應激期放牧妊娠牛血清免疫功能相關指標的影響

由表5可知，在試驗第60天，試驗組妊娠牛血清IL-2和IL-4含量顯著高于對照組(P<0.05)，隨著營養調控的持續進行，試驗組組內妊娠牛血清IgA、IgM和IgG含量均有顯著提高，其中IgA和IgM含量在試驗第60天較第1天有顯著提高(P<0.05)，IgG含量在試驗第30天和第60天較第1天有顯著提高(P<0.05)。而在營養調控的過程中，2組妊娠牛血清LZ活性在組內和組內組間均無顯著差異(P>0.05)。

表5 營養調控對慢性熱應激放牧妊娠牛血清免疫功能相關指標的影響

續表5項目Items時間Time/d試驗組Experiment group對照組Control groupP值P-value 白細胞介素-2 IL-2/(pg/mL)1602.18±129.43594.71±84.650.937 330576.91±73.39641.71±95.920.405 3 60711.55±85.58a530.69±44.84b0.031 6 白細胞介素-4 IL-4/(pg/mL)148.54±8.0147.73±4.590.886 93046.44±6.4349.78±6.760.568 66060.14±5.63a45.39±6.67b0.046 5

2.4 營養調控對慢性熱應激期放牧妊娠牛血清抗氧化能力相關指標的影響

由表6可知，在整個試驗期間，試驗組組內妊娠牛血清GSH-Px活性和T-AOC顯著增加(P<0.05)，試驗期第30天和第60天較第1天有顯著提高(P<0.05)，在試驗第60天，試驗組血清GSH-Px活性顯著高于對照組(P<0.05)。而2組妊娠牛血清SOD活性和MDA含量組內組間均無顯著差異(P>0.05)，但試驗組血清SOD活性有高于對照組的趨勢。

表6 營養調控對慢性熱應激放牧妊娠牛血清抗氧化相關指標的影響

3 討 論

3.1 營養調控對慢性熱應激期放牧妊娠牛血清生殖激素含量的影響

動物的繁殖功能主要受到下丘腦-垂體-性腺軸的調控[16]。高溫刺激產生的非特異性生理反應會抑制下丘腦的活動，進而影響生殖相關激素的分泌。而E2是卵巢分泌的重要性激素，對于維持妊娠與PROG起協同作用。PROG可抑制子宮肌收縮，維持妊娠，有保胎作用。有研究表明，妊娠母牛遭受熱應激時,體內PROG和E2含量降低[17]。在本研究中，試驗組妊娠牛血清PROG和E2含量顯著高于對照組，表明營養調控對慢性熱應激下妊娠牛PROG和E2的分泌有積極作用，在一定程度上可以保胎，降低流產風險。垂體分泌的FSH等促性腺激素的主要功能是控制卵巢的內分泌活動，間接對子宮內膜適應胚泡附植的各種變化產生影響。有研究證實，熱應激會降低卵巢類固醇激素及促性腺激素的分泌[18]。本試驗中，2組牛血清FSH含量差異不顯著，主要原因可能是由于妊娠期間卵巢內卵泡不再發育成熟，也無法排卵，所以血清FSH含量沒有顯著增加。在妊娠期間體內PRL含量會隨孕期進展而逐漸升高，而在熱應激情況下，促腎上腺皮質激素(ACTH)大量分泌會干擾垂體前葉分泌PRL等激素[19]。營養攝入不足時，神經-內分泌系統導致催乳素抑制因子(PIF)增加，催乳素釋放因子(PRF)減少，最終引起PRL的分泌減少，試驗組組內妊娠牛血清PRL含量有顯著提高，通過營養調控可以改善熱應激期妊娠牛的PRL分泌狀況。甲狀腺素是調節機體代謝的重要激素，熱應激時肉牛甲狀腺機能減弱，代謝率降低，產熱減少，以增加機體對炎熱環境的適應，血清T3含量會明顯降低[20]，母牛妊娠期機體內E2含量增加，E2可以引起肝臟甲狀腺素結合球蛋白(TBG)的合成增加，TBG與甲狀腺素的結合力提高[21]，也會導致血清中游離T3含量的降低。李妍等[22]研究表明，T3、甲狀腺素(T4)含量隨著飼糧營養水平的提高而增加，與本研究結果一致。提高營養水平會提高妊娠牛機體內T3含量，改善熱應激狀態下的甲狀腺機能。

3.2 營養調控對慢性熱應激期放牧妊娠牛血清免疫功能相關指標的影響

免疫球蛋白主要參與體內體液免疫，負責機體保護性的免疫應答和自身的穩定，其在血清中水平的高低是評估免疫狀況的重要指標，血清中球蛋白含量體現了機體免疫功能強弱[23]。本研究中的試驗動物長期生存在熱應激環境，有報道證實熱應激會導致牛免疫功能下降[10]，且試驗所選取的天然牧場每日較大的溫差還可能產生溫差應激反應，出現神經系統、內分泌系統、免疫系統等生理紊亂，抵抗力下降，影響生產效益[24]。在本研究中，試驗組組內妊娠牛血清IgA、IgM和IgG含量顯著升高。由于PRL不僅可以促進乳腺發育和泌乳，還可以促進IgA的分泌；E2可以促進IgA和IgG的分泌，妊娠期間隨著母牛體內PRL和E2分泌的增加可提高機體免疫功能。白細胞介素(IL)主要由T細胞產生，能調控免疫細胞。據報道，奶牛遭受熱應激侵襲時，機體內淋巴細胞功能受到抑制，免疫因子含量降低，進而降低奶牛免疫功能[25]。本研究中通過營養調控顯著提高了慢性熱應激妊娠牛血清IL-2和IL-4含量，在一定程度上增強免疫機能，減輕熱應激對機體造成的損害。

3.3 營養調控對慢性熱應激期放牧妊娠牛血清抗氧化能力相關指標的影響

當動物體處于熱應激狀態時，機體代謝水平提高，細胞產生過量且無法被及時清除的活性氧(ROS)自由基過多[26]，損傷機體的正常生理機能。有研究表明，妊娠期胚胎-胎盤-母體間的血液循環完全建立以后，胎盤內的氧濃度迅速增加[27]。隨著胎兒的生長，所需要的營養物質增多，通過胎盤排泄的代謝物增多，母體的各個系統、器官的代謝負荷加重，細胞活動所產生的ROS也不斷增加[28]。有試驗證明在熱應激條件下，肉牛血清中的T-AOC、SOD和GSH-Px活性較非熱應激條件明顯降低，使機體抗氧化能力減弱[29]。飼糧營養、生理階段、生長環境等有可能導致機體自由基水平變化的因素都能導致機體抗氧化物質含量變化。而飼糧營養水平對機體抗氧化的影響研究報道較少，本試驗的營養調控主要是在牧草的基礎上補充了蛋白質、礦物質以及維生素(維生素A、維生素D和維生E),對慢性熱應激狀態下的妊娠母牛機體清除自由基有積極作用，減少氧化物的生成，可以增強抗氧化防御系統的能力。

4 結 論

夏季天然草場放牧的妊娠牛長時間處于晝夜溫差較大的熱應激狀態，在本試驗條件下，通過營養補飼有效地提高了放牧條件下妊娠牛的免疫功能和抗氧化能力，緩解了熱應激對肉牛健康的危害，且顯著提高了妊娠牛血清繁殖激素含量，對母牛繁殖性能的發揮具有積極作用。