白藜蘆醇通過抑制炎癥和細胞凋亡預防脂多糖對小鼠肝臟的損傷

李 川 張 逢,2 陳指龍 楊 青* 袁安文*

(1.湖南農業大學動物醫學院，長沙410128；2.湖南中醫藥大學科技創新中心，長沙410208)

肝臟是機體重要的代謝器官，參與許多生物過程，包括新陳代謝、免疫反應、蛋白質合成、解毒和抗菌防御等[1]。多種刺激如病原微生物感染、毒素等可誘導肝臟發生炎癥反應，造成慢性肝損傷，如不及時治療可導致肝纖維化、肝硬化和肝細胞功能不全甚至肝癌等[2-3]。脂多糖(LPS)又稱內毒素，是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分。腸道源性細菌內毒素是導致多種肝病炎癥的重要機制之一，肝臟中LPS水平的增加會導致肝細胞損傷，刺激肝巨噬細胞釋放許多促炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1、IL-6等，誘導肝臟免疫反應，促進肝臟發生炎癥、細胞發生凋亡甚至死亡等[4-7]。研究表明許多植物功能成分對肝臟損傷具有很好的保護作用[8-9]。由于植物功能成分具有安全、無應激、無殘留等特性，深入研究其抗炎作用效果并了解其作用機制可為肝臟炎癥的防治提供理論基礎。白藜蘆醇(RES)是一種非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于葡萄、花生、虎杖等70余種植物或其果實中，其可減輕因許多因素誘導的肝臟損傷[10-11]。李向陽等[12]研究發現，在卡介苗和LPS聯合誘導的小鼠急性肝損傷模型中，RES可降低小鼠血清中丙氨酸轉氨酶的活性及肝臟組織中丙二醛的含量，同時可提高肝臟組織中超氧化物歧化酶的活性和血清中一氧化氮的含量，對肝臟起到較好的保護作用。在四氯化碳誘導的急性肝損傷模型中，RES可通過抑制Nod樣受體家族3(NLRP3)炎性體的活化及其下游的炎癥級聯反應減少肝小葉內壞死灶、中性粒細胞浸潤及肝細胞的受損面積，從而減輕肝臟的損傷[13]。另外，RES可通過體內外抑制凋亡在多種組織和細胞中發揮其抗凋亡作用。在肝臟缺血再灌注損傷(HIRI)大鼠模型中，RES聯合異丙酚抑制肝臟細胞凋亡，對HIRI大鼠肝臟產生了一定的保護作用[14]。本課題組前期研究發現，利用LPS急性暴露可破壞機體中炎癥因子的平衡，誘導全身性的炎癥反應[15]，但RES預處理對LPS單獨誘導的急性肝臟損傷的作用尚不完全明確。本研究利用LPS誘導小鼠急性肝臟損傷，研究不同濃度的RES預處理對肝臟組織病理學損傷、相關細胞凋亡因子及促炎癥細胞因子表達的影響，探討RES對肝臟損傷的預防效果及其可能的作用機制，以期為肝臟損傷的防治及RES在動物營養中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物分組及處理

試驗動物為健康的8周齡ICR系雄性小鼠，體重30～35 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，自由攝食和飲水。適應性飼養1周后，將小鼠隨機分為5組，即對照組、LPS組、RES-L+LPS組、RES-M+LPS組、RES-H+LPS組，每組10只。RES溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，用時根據小鼠體重稀釋為10(低劑量)、20(中劑量)和40 mg/kg BW(高劑量)3個劑量。RES-L+LPS組、RES-M+LPS組、RES-H+LPS組每天分別灌胃300 μL含10、20和40 mg/kg BW RES的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，連續灌胃28 d，期間對照組和LPS組灌胃等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。預處理結束后，3個RES+LPS組和LPS組腹腔注射200 μL LPS(5.0 mg/kg BW)，該劑量根據本課題組前期研究結果[15]確定，對照組腹腔注射等體積生理鹽水，12 h后稱重(20:00注射LPS，第2天08:00采樣)，脫頸處死，收集肝臟并稱重，計算肝臟指數(肝臟指數=100×肝臟濕重/小鼠體重)。取所有小鼠肝臟組織，部分用10%多聚甲醛固定，用于制作石蠟切片；部分保存于-80 ℃，用于目的基因 mRNA和目的蛋白表達分析。

1.2.2 HE染色法觀察肝臟組織病理學

將固定好的肝臟組織用常規梯度酒精進行脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋后切片，厚度為5 μm。將石蠟切片放入二甲苯脫蠟，依次經梯度酒精處理至復水后，分別用HE染液進行染色，脫水，中性樹膠封片，在顯微鏡觀察肝臟組織的病理學變化。

1.2.3 原位缺口末端標記(TUNEL)法檢測肝臟細胞凋亡情況

根據試劑盒提供的說明書進行操作，將肝臟組織石蠟切片二甲苯脫蠟2次，每次10 min，無水乙醇5 min，90%酒精2 min，70%酒精2 min，蒸餾水2 min。用20 μg/mL的蛋白酶K工作液室溫作用20 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3 min；在樣品上滴加50 μL預先配制的TUNEL檢測液，于濕盒內37 ℃避光孵育1 h，PBS洗滌3次；滴加50 μL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液染核，用抗熒光淬滅劑封片后于熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光為凋亡信號。利用Image J軟件對熒光信號強度進行分析。

1.2.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測肝臟中炎癥因子和凋亡相關基因的mRNA表達水平

1.2.5 蛋白質免疫印跡(Western Blot)法檢測肝臟中凋亡相關蛋白的表達水平

取少量肝臟組織，加入RIPA細胞裂解液(含1% PMSF)后用勻漿機進行勻漿，冰上放置30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min后吸取上清，進行蛋白質濃度測定、變性、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離以及轉印。待蛋白轉印至PVDF膜上后用0.2%明膠(溶于TBST)室溫封閉1 h；隨后加入一抗(Bax，1∶1 000稀釋；Bcl-2，1∶1 000稀釋；GAPDH，1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜；TBST充分洗滌后加入相應的HRP標記的二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗滌；ECL發光液進行顯色，于ChemiDocTMXRS+成像系統中檢測蛋白質條帶并用Image Lab軟件條帶灰度進行分析，目的蛋白以GAPDH為內參進行校正。

1.3 數據統計分析

試驗數據以平均值±標準差(mean±SD)表示，利用SPSS 17.0統計軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD法檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 RES預處理對LPS誘導小鼠體重和肝臟指數的影響

RES預處理對LPS誘導小鼠體重和肝臟指數的影響如表1所示。低、中、高3個劑量的RES預處理小鼠28 d后，對小鼠的體重均無顯著影響(P>0.05)；用LPS誘導后，相對于對照組，LPS組和3個RES+LPS組小鼠體重均顯著下降(P>0.05)，但LPS組和3個RES+LPS組間無顯著差異(P>0.05)。同時，LPS誘導后使小鼠肝臟濕重顯著增加(P<0.05)；肝臟指數結果顯示，LPS誘導可導致小鼠肝臟指數顯著上升(P<0.05)，而低、中、高3個劑量的RES預處理均可顯著或極顯著下調肝臟指數(P<0.05或P<0.01)，并可達到與對照組差異不顯著的水平(P>0.05)。

2.2 RES預處理對LPS誘導小鼠肝臟組織形態的影響

肝臟組織病理學觀察結果如圖1所示。對照組小鼠肝臟組織、肝血竇以及中央靜脈無明顯變化，肝細胞輪廓清晰；LPS誘導后，肝臟中央靜脈出現充血，紅細胞堆集等情況，肝細胞發生腫脹，部分細胞核深染。3個RES預處理組，中央靜脈隨RES劑量增加其充血減少，肝細胞腫脹也明顯減少，以高劑量RES組效果較好。以上結果說明RES能夠在一定程度上預防由LPS誘導所引起的肝臟組織病理損傷。

2.3 RES預處理對LPS誘導小鼠肝臟細胞凋亡的影響

TUNEL凋亡染色如圖2所示。與對照組相比，LPS誘導后可觀察到紅色熒光信號的細胞顯著增多，肝細胞凋亡比例極顯著增加(P<0.01)；RES預處理作用效果顯示，低劑量的RES對LPS誘導的肝臟細胞凋亡無顯著作用，其肝細胞凋亡比例與LPS組相比無顯著變化(P>0.05)，而中、高劑量的RES均能顯著抑制LPS誘導所致的肝臟細胞發生凋亡，其肝細胞凋亡比例與LPS組相比極顯著降低(P<0.01)，且以高劑量的RES預防作用效果較好。上述結果說明RES能在一定程度上減少LPS引起的肝臟細胞凋亡。

表1 RES預處理對LPS誘導小鼠體重和肝臟指數的影響

A：對照組 CON group；B：LPS組 LPS group；C：RES-L+LPS組 RES-L+LPS group；D：RES-M+LPS組 RES-M+LPS group；E：RES-H+LPS組 RES-H+LPS group。下圖同 The same as below。

2.4 RES預處理對LPS誘導小鼠肝臟中IL-6和TNF-α mRNA表達的影響

本試驗檢測了肝臟中炎癥因子IL-6和TNF-α mRNA的表達水平的變化，結果如圖3所示。LPS誘導后，肝臟中IL-6和TNF-α mRNA的表達水平均極顯著升高(P<0.01)；各劑量RES預處理組肝臟中IL-6和TNF-α mRNA的表達水平極顯著低于LPS組(P<0.01)，但仍極顯著高于對照組(P<0.01)。上述結果說明RES可在一定程度上通過下調肝臟中部分促炎因子的表達減輕由LPS誘導所致的肝臟炎性損傷。

2.5 RES預處理對LPS誘導小鼠肝臟中Bcl-2和Bax mRNA和蛋白表達的影響

本試驗檢測了肝臟中凋亡因子Bcl-2和BaxmRNA和蛋白的表達水平，結果如圖4所示。LPS誘導可極顯著提高促凋亡基因BaxmRNA的表達水平(P<0.01)，同時極顯著抑制抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達水平(P<0.01)；用RES進行預處理，LPS對Bax和Bcl-2 mRNA表達的誘導作用受到抑制，3種劑量的RES預處理均可極顯著提高Bcl-2 mRNA的表達水平(P<0.01)，且可達到與對照組無顯著差異的水平(P>0.05)；3種劑量的RES預處理可顯著或極顯著降低BaxmRNA的表達水平(P<0.05或P<0.01)，但仍極顯著高于對照組(P<0.01)。LPS對Bax蛋白的作用其mRNA類似，使得Bax蛋白的表達水平極顯著升高(P<0.01)，但Bax蛋白的表達水平受RES的抑制作用更強烈，3種劑量的RES預處理均使Bax蛋白的表達水平極顯著降低(P<0.01)，且可使其下降到與對照組無顯著差異的水平(P>0.05)；與其對Bcl-2 mRNA的作用相反，LPS誘導使得Bcl-2蛋白的表達水平極顯著上升(P<0.01)，當用不同劑量RES預處理時，對Bcl-2蛋白的表達水平無顯著影響(P>0.05)。

圖a：TUNEL染色肝臟組織。DAPI：肝臟細胞核染色(藍色)；TUNEL：凋亡細胞或血細胞染色(紅色)。標尺大小500 μm。圖b：TUNEL染色陽性細胞的量化和統計分析。

圖3 RES預處理對LPS誘導小鼠肝臟中IL-6和TNF-α mRNA表達的影響

3 討 論

研究表明LPS進入機體會使許多器官產生不同程度的損傷，當進入肝細胞時會刺激巨噬細胞釋放大量的炎癥因子，產生細胞毒作用，通過細胞凋亡等多種途徑損傷肝細胞[16-17]。在付凌等[18]利用牛磺酸抗LPS誘導的小鼠肝臟損傷研究中，腹腔注射LPS(L18716，10 mg/kg BW)誘導24 h可導致體重下降、肝臟指數上升并出現明顯的肝臟損傷。本課題組前期研究結果顯示，腹腔注射較低劑量(5 mg/kg BW)的LPS誘導小鼠12 h后就可導致其體重顯著下降[15]，而在本試驗中進一步發現LPS誘導后也可顯著增加小鼠的肝臟指數，誘導所需的劑量和時間較短，這可能與不同來源LPS的毒力不同有關。肝臟指數的上升是由于LPS導致促炎因子(如TNF-α、IL-6)水平的上升，肝臟充血，肝細胞腫脹等炎癥的發生，使肝臟濕重增加，此外，與體重下降也密切相關。

圖4 RES預處理對LPS誘導小鼠肝臟中Bcl-2和Bax mRNA和蛋白表達的影響

RES作為一種具有重要活性的多酚類化合物，對多種刺激誘導所致的肝臟損傷具有較好的保護作用。TNF-α是肝衰竭的早期炎癥因子，通過轉導肝細胞凋亡信號，誘導其他相關炎癥因子級聯反應，從而加重肝壞死[19]。IL-6是IL家族的核心成員，在B細胞分化、T細胞增殖等方面發揮著重要的作用，是反映機體炎癥和疾病嚴重程度的指標之一。當肝臟中TNF-α和IL-6 mRNA表達水平升高時，被認為是肝臟損傷的一個標志[20]。夏玉敬等[21]研究發現，RES對刀豆蛋白誘導引起的急性肝臟損傷有明顯的保護作用，可降低炎癥因子IL-2、IL-6和TNF-α mRNA的表達。周薏等[13]研究發現，RES可通過抑制NLRP3炎性體活化及其下游炎癥級聯反應，顯著減輕四氯化碳誘導的急性肝臟損傷。本試驗中也發現RES可在一定程度上預防LPS誘導所致的肝臟組織病理變化，且高劑量的RES效果較好；RES預處理可顯著抑制肝臟中促炎因子IL-6和TNF-α mRNA表達水平的上升。

在正常情況下，氧化應激可使機體適應各種刺激保護細胞免受損傷，多種有害刺激可以打破氧化應激的平衡狀態，促使細胞發生凋亡甚至導致病理損傷。細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，在凋亡信號誘導下，胞質中的促凋亡蛋白Bax形成Bax-Bax二聚體，破壞線粒體外膜的完整性，使細胞色素C向細胞質中釋放，激活半胱天冬酶-3(Caspase-3)導致細胞凋亡[22]。存在于線粒體外膜上的抗凋亡蛋白Bcl-2可競爭性的與Bax結合，形成Bax-Bcl-2二聚體，從而中和Bax的促凋亡作用[23]。本研究通過檢測Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表達水平驗證RES能否抑制LPS對小鼠肝臟細胞的凋亡，發現LPS使Bax的mRNA和蛋白表達水平均極顯著升高，不同劑量的RES預處理均使Bax蛋白的表達水平極顯著降低，且可使其下降到與對照組無顯著差異的水平；而LPS誘導對Bcl-2的mRNA和蛋白表達水平的影響不一致，LPS誘導使得Bcl-2 mRNA表達水平極顯著降低，而使Bcl-2蛋白的表達水平顯著上升，可能是由于mRNA轉錄與蛋白質翻譯水平不一致所造成的。RES可誘導多種癌細胞發生凋亡，發揮其體內外抗腫瘤作用[24]，但對多種因素誘導的正常細胞凋亡具有顯著的抑制作用。孫菁等[25]研究發現，刀豆素A誘導的小鼠自身免疫性肝炎(AIH)模型中，肝臟組織中出現大量的凋亡細胞，RES預處理后能夠顯著減少AIH小鼠肝臟的細胞凋亡比例。在肝切除術的大鼠模型中，RES可降低術后肝臟損傷，維持肝臟結構，減少細胞凋亡，體外試驗發現其可能是通過上調沉默信息調節因子2相關酶1(SIRT1)和降低高遷移率族蛋白1(HMGB1)的乙酰化來實現的[26]。本研究通過TUNEL原位檢測發現LPS誘導可導致肝臟細胞凋亡比例增加，而RES預處理時可顯著抑制細胞發生凋亡，在一定程度抑制促凋亡基因Bax的表達。目前，RES雖在預防和治療多種慢性疾病，包括心血管疾病、炎癥性疾病、代謝性疾病、神經系統疾病和皮膚疾病及各種傳染病方面作用效果較好[27]，但闡明其在多種生理條件下的作用機制還需進一步探索。

4 結 論

RES預處理可在一定程度上抑制LPS的炎癥誘導作用，通過抑制肝臟中炎癥因子TNF-α和IL-6的表達降低炎性損傷，并通過抑制肝臟中促凋亡基因Bax的表達減少細胞凋亡，對肝臟損傷起到較好的保護作用。