GC-MS 分析‘利王柚’果實黃皮層揮發性物質成分*

李文云，羅 懌，王小柯，韓秀梅，鄭乾明，林 乾，蔡永強，李金強

（貴州省農業科學院果樹科學研究所，貴陽 550006）

隨著果實的成熟，會產生大量的揮發性物質，從而賦予果實獨特怡人的風味。雖然成熟果實揮發性物質占果實總重的比率不足1%，但這些揮發性物質不僅是果實品質的重要組成部分，還成為影響消費者購買習慣的重要因素[1-2]。目前，已鑒定的植物揮發性物質超過23 000 種，以柑橘為原材料提取的精油具有寧神、止咳、消炎和清除自由基等多種功效，在食品、藥品、化妝品等行業具有廣泛的應用[3-4]。柑橘中揮發性物質種類主要包括單萜、倍半萜、萜類衍生物、酮、醛、酸、酯等，其中大部分為萜類，約占總揮發性物質含量的80%以上[5]。由于品種類型、成熟度、氣候條件和栽培措施的差異，不同柑橘品種揮發性物質組成和含量存在較大的差異[6]。

‘利王柚’原產于貴州省銅仁市碧江區和平鎮利王村，是由地方品種‘利王白柚’芽變選種得到的，其果肉呈現誘人的粉紅色，口感酸甜，香味較‘利王白柚’濃郁[7-8]。本研究利用GC-MS 檢測了‘利王柚’‘利王白柚’和‘金錢橘’成熟果實黃皮層揮發性物質組成，比較了揮發性物質成分和含量特征，以期為貴州省地方特色種質資源評價與利用及柑橘品質改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為‘利王柚’‘利王白柚’和‘金錢橘’，采樣時選擇至少3 株生長健壯、無病蟲害的植株，從樹冠外圍隨機采收15 個成熟果實帶回實驗室，用蒸餾水清洗果面，用手術刀小心分離果實最外層黃皮層，設置3 次重復，于液氮中速凍，隨后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存待測。

1.2 試驗方法

參照Liu 等柑橘果實揮發性物質提取方法[9]，稱取0.2 g 分離好的黃皮層，加液氮研磨至細粉末狀。加入500 μL 雙蒸水，充分混勻。再加入500 μL 含壬酸甲酯的MTBE 溶液，充分混勻。于4 ℃超聲提取30 min 后10 000 r/min 離心，吸取上清液，過濾膜至進樣瓶中。利用 GC-MS 分離檢測揮發性物質組分，進樣體積設置為1 μL，儀器運行參數參照Liu等方法[10]。

1.3 數據分析

參照儀器自帶揮發性物質數據庫和物質特征離子數據，對揮發性物質進行定性；參照已知濃度內標（壬酸甲酯）峰面積推算目標物質的濃度。利用 Microsoft Office Excel 進行數據統計和作圖。利用SPSS 進行差異顯著性分析；對揮發性物質進行歸一化處理后，利用R 軟件OPLS-DA（正交偏最小二成判別分析）模型計算VIP 值（變量重要性投影）。

2 結果與分析

2.1 揮發性物質總離子流圖

‘利王柚’‘利王白柚’和‘金錢橘’3 份材料黃皮層揮發性物質總離子流圖見圖1。根據揮發性物質數據庫、物質特征離子碎片和內標物質濃度分別對物質進行定性和定量分析。從圖1 可以直觀地看出，3 份材料揮發性物質出峰時間、峰高和峰面積存在較大差異。

圖1 ‘利王柚’‘利王白柚’和‘金錢橘’3 份材料揮發性物質總離子流圖

2.2 揮發性物質種類分析

檢測結果表明，共檢測到72 種揮發性物質，主要包括單萜、倍半萜及其衍生物，以及醛、醇、酸、酯等（表1）。

表1 ‘利王柚’‘利王白柚’和‘金錢橘’3 份材料揮發性物質含量

按揮發性物質種類多少排序，依次為：倍半萜19 種、單萜12 種、單萜醇11 種、醛10 種、單萜醛4 種、單萜氧化物4 種、酯4 種、醇3 種、酸3種、單萜酮2 種。

續表1

3 份材料黃皮層揮發性物質個數見表2，其中‘金錢橘’檢測到的揮發性物質總數最多，共50個；其次是‘利王柚’，檢測到44 個；‘利王白柚’最少，僅檢測到42 個。

表2 ‘利王柚’‘利王白柚’和‘金錢橘’3 份材料檢測到的揮發性物質個數 個

從3 份材料揮發性物質占比來看（圖2），單萜類所占的比重最大，占62.33%～92.01%；單萜衍生物（單萜醛、單萜醇、單萜酮、單萜氧化物）占2.96%～28.80%；倍半萜占1.29%～5.50%；其他類揮發性物質（醛、醇、酸、酯）僅占0.86%～4.76%。各類揮發性物質按占比高低排序，‘利王柚’依次為單萜（62.33%）＞單萜衍生物（28.80%）＞倍半萜（5.50%）＞其他（3.36%），‘利王白柚’依次為單萜（85.89%）＞單萜衍生物（8.05%）＞其他（4.76%）＞倍半萜（1.29%），‘金錢橘’依次為單萜（92.01%）＞倍半萜（4.17%）＞單萜衍生物（2.96%）＞其他（0.86%）。

圖2 ‘利王柚’‘利王白柚’和‘金錢橘’3 份材料揮發性物質占比情況

2.3 揮發性物質含量比較分析

從檢測的揮發性物質總含量來看（表1），‘金錢橘’最高，為4 098.87 μg/g，其次是‘利王柚’，為1 763.12 μg/g，‘利王白柚’最低，為852.42 μg/g，‘金錢橘’總含量分別是‘利王柚’和‘利王白柚’的2.32、4.81 倍。此外，單萜類、倍半萜類、單萜醇類和醛類4 類揮發性物質總含量‘金錢橘’黃皮層中最高，其次是‘利王柚’和‘利王白柚’。3份材料含量最高的揮發性物質均是單萜類，含量為734.73～3 771.80 μg/g，其中‘金錢橘’單萜總含量分別是‘利王柚’和‘利王白柚’的3.43、5.13 倍。倍半萜類是所檢測的物質中種類最多的，倍半萜類總含量為11.04～171.11 μg/g，‘金錢橘’倍半萜總含量分別是‘利王白柚’和‘利王柚’的15.50、1.76 倍。從單萜衍生物來看，‘金錢橘’單萜醇總含量最高，為101.15 μg/g，分別是‘利王柚’和‘利王白柚’的1.36、5.81 倍。

單萜醛類、單萜酮類、單萜氧化物類、醇類、酸類和酯類6 類揮發性物質總含量均在‘利王柚’中最高。這6 類揮發性物質中，單萜酮類含量在‘利王柚’中最高。值得關注的是，柚類的特征香味物質諾卡酮含量在‘利王柚’和‘利王白柚’中極顯著高于‘金錢橘’（P＜0.01），分別為406.38、39.19 μg/g，而‘金錢橘’中未檢測到該物質。單萜醛類、單萜氧化物類、醇類、酸類和酯類5 類物質雖然占總揮發性物質的比率較低，但差異代謝物較多，其中‘金錢橘’未檢測到醇類。

2.4 差異化揮發性物質

我們將3 份材料進行兩兩比較篩選差異揮發性物質，分組結果如下：‘利王柚’和‘利王白柚’、‘利王柚’和‘金錢橘’、‘利王白柚’和‘金錢橘’。樣品質控數據和統計分析結果表明（表3），利用OPLS-DA 模型建立的R2值和Q2值均較高，此模型用于分析差異化揮發性物質的可信度較高。

表3 基于OPLS-DA 模型分組比較的R2和Q2值

從OPLS-DA 模型結果中，篩選VIP 值＞1 且差異顯著性P＜0.05 的揮發性物質則為差異代謝物。3 份材料均可檢測到的揮發性物質有α-蒎烯、β-蒎烯、崖柏烯、β-月桂烯、d-檸檬烯、吉瑪烯B、α-布藜烯、β-檸檬醛、α-檸檬醛、芳樟醇、α-萜品醇、順式-香葉醇、α-菖蒲烯醇、蓽澄茄醇、順式-芳樟醇氧化物、順式-檸檬烯氧化物、反式-檸檬烯氧化物、己醛、2-己烯醛等，共19 種。

兩兩差異化揮發性物質比較分析結果表明（圖3，表4～表6），差異代謝物的個數與柑橘種類密切相關。‘利王柚’和‘利王白柚’差異代謝物僅篩選到石竹烯、β-蒎烯、法呢醇等13 個差異代謝產物，其中上調12 個，下調1 個。而‘利王白柚’‘利王柚’與‘金錢橘’的親緣關系較遠，篩選到的差異代謝物較多。‘利王白柚’和‘金錢橘’共篩選到α-水芹烯、二十二碳六烯酸、反式-2-十二醛等24 個差異代謝產物，其中上調7 個，下調17個；‘利王柚’和‘金錢橘’共篩選到諾卡酮、順式-香葉醇、反式-芳樟醇氧化物等27 個差異代謝產物，其中上調14 個，下調13 個。

圖3 3 份材料兩兩比較差異揮發性物質個數

3 討論與結論

揮發性物質是果實品質的重要組成部分，除了參與植物防御和輔助傳粉外，提取的精油具有愉悅的香味，具有鎮定、安神等多種功效，在臨床、食品、美容等行業具有重要的應用[11-12]。揮發性物質由多種復雜的化合物質組成，其代謝途徑涉及異戊二烯途徑、莽草酸途徑、脂肪酸裂解途徑等多個復雜的通路，涉及的物質類型也較多[13]。本研究單萜類物質在所有揮發性物質中占比最大，這類物質具有抗腫瘤、緩解糖尿病、抑菌等多種生物學活性[14-15]。3份材料中，‘金錢橘’所檢測到的揮發性物質種類最多，含量最高；鐘煉軍等[4]對12 個柑橘揮發性物質分析結果同樣表明，橘類種類最多，含量最高。

果實揮發性物質因種類、品種、成熟度的不同而存在較大的差異，不同種類的柑橘都有其獨特的揮發性物質構成并賦予果實怡人的香氣[16]。蘆柑揮發性物質以金合歡烯、正十一醛、紫蘇醛等為主，臍橙揮發性物質以檜烯、月桂醛、3-蒈烯等為主[17]。

表4 ‘利王柚’和‘利王白柚’篩選的差異代謝物

表5 ‘利王白柚’和‘金錢橘’篩選的差異代謝物

表6 ‘利王柚’和‘金錢橘’篩選的差異代謝物

黃皮揮發性物質以β-水芹烯、d-檸檬烯、石竹烯、α-水芹烯、α-金合歡烯等為主[18]。差異代謝物篩選結果表明，差異代謝物的個數與柑橘類型息息相關，種類差異越大差異代謝物的個數越多。因‘利王柚’是來源于‘利王白柚’的芽變，都屬于柚類，因此二者的揮發性物質成分更為相近，僅篩選到13個差異物質。而‘金錢橘’屬于寬皮柑橘類，‘利王白柚’和‘金錢橘’、‘利王柚’和‘金錢橘’分別篩選到24、27 個差異物質，體現了不同種類柑橘積累揮發性物質特征，從而賦予不同柑橘種類具有其獨特的香味。進一步分析結果表明，‘利王柚’和‘利王白柚’親緣關系更近，同時也說明了利用揮發性物質可以作為區分柑橘種類的方法之一。與Yu 等[19]研究結果一致，他們在利用揮發性物質對橘、酸橙、血橙、溫州蜜柑、克里曼丁橘等進行聚類分析時，能夠將不同種類的柑橘明顯區分開，并利用分子標記驗證了該結果，說明了基于揮發性物質對柑橘種類進行分類的可靠性。