多肽SJMHE1調控Th17/Treg細胞平衡以及對哮喘小鼠治療作用的研究

馮玎琦，單文琪，毛佳慧，舒揚，汪毅，汪雪峰

(江蘇大學附屬醫院中心實驗室，江蘇 鎮江 212001)

哮喘是一種全球性常見的慢性呼吸系統疾病，其本質是氣道性炎癥，主要病理學特征是氣道的高反應性和結構重塑。哮喘的發病機制復雜，不同患者之間存在顯著差異，涉及多種免疫細胞、免疫分子以及多條炎癥相關的信號通路參與[1]。因此，精準醫學治療對緩解哮喘病癥尤為重要。現有研究表明，CD4+T細胞亞群失衡及相關細胞因子異常釋放是發生氣道損傷、炎癥反應和功能障礙的主要原因。其中輔助性T細胞17(helper T cell 17,Th17細胞)/調節性T細胞(regulatory T cell,Treg細胞)失衡能夠促進中性粒細胞在肺組織中的活化和募集，該機制在哮喘的發生發展中起重要作用[2-3]。

Th17和Treg細胞具有相互拮抗的免疫學功能。Treg細胞負責維持自身耐受、抑制自身免疫，而Th17細胞則參與炎癥的誘導[4]。在正常情況下兩者共同維持機體免疫系統處于平衡狀態，但在疾病狀態下，該平衡被打破且易向Th17細胞方向偏移。因此，Th17/Treg細胞失衡被公認為是導致和加劇過敏性或自身免疫性疾病的重要原因之一[5]。

日本血吸蟲熱激蛋白來源多肽SJMHE1是一種具有免疫調節活性的非特異性小分子肽，包含多個人和小鼠CD4+T細胞表位。前期研究發現，SJMHE1不僅可以有效抑制小鼠的遲發性超敏反應，還可以減輕膠原誘導性關節炎小鼠的炎癥反應和毒副反應[6-7]。本研究旨在探索SJMHE1對Th17/Treg細胞平衡的調控以及在小鼠過敏性哮喘治療中的作用，為今后的臨床轉化提供必要的實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體級近交系BALB/c小鼠18只，雄性，6～8周齡，體重18～20 g，購自揚州大學比較醫學中心[生產許可證：SCXK(蘇)2017-0007]，飼養于江蘇大學動物實驗中心。動物實驗遵循江蘇大學動物保護和使用委員會指南協議。

1.2主要試劑 小鼠CD4+T細胞磁珠分選試劑盒(加拿大STEMCELL公司，批號：19852)。小鼠T細胞活化試劑盒(德國Miltenyi公司，批號：130-093-627)。多肽SJMHE1，序列為VPGGGTALLRCIPVLDTLSTKNED，上海淘普生物公司合成并純化。異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)標記的抗鼠CD4抗體，藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)標記的抗鼠白細胞介素(interleukin,IL)-17抗體，PE標記的抗鼠叉頭框蛋白P3(forkhead box protein P3,FoxP3)抗體，別藻藍蛋白(allophycocyanin,APC)標記的抗鼠CD25抗體(美國Invitrogen公司，批號：11-0041-82、12-9171-80、12-5773-80、17-0251-81)。佛波酯/離子霉素混合液，布雷非德菌素A/莫能霉素混合液(杭州聯科生物公司，批號：CS1001、CS1002)。細胞固定/破膜試劑盒(美國BD公司，批號：554714)。FoxP3/轉錄因子染色試劑盒(美國Invitrogen公司，批號：00-5523-00)。第一鏈cDNA高效合成逆轉錄試劑盒(美國GeneCopoeia公司，批號：QP056)。實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒(美國GeneCopoeia公司，批號：QP031)。小鼠組織解離試劑盒(德國Miltenyi公司，批號：130-095-927)。

1.3實驗方法

1.3.1免疫磁珠法分離CD4+T細胞 在無菌環境中摘取1只正常小鼠脾臟置于篩網中，充分研磨過濾，收集細胞懸液在4 ℃、500×g的條件下離心5 min，計算細胞數量。用含2%胎牛血清的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)重懸細胞至濃度為1×108cells/mL，置于5 mL聚苯乙烯圓底試管內，加入50 μL/mL的分選混合物試劑，充分混勻，室溫孵育10 min。加入75 μL/mL 的分選磁珠，充分混勻，室溫孵育5 min。加入PBS至2.5 mL，將圓底試管插入磁鐵內，室溫靜置3 min。將富集的細胞懸液倒入新的試管中，計算細胞數量。

1.3.2CD4+T細胞的體外培養 選用24孔培養板，每孔接種1×106個分選出的CD4+T細胞，每孔加入10 μL預混小鼠T細胞活化試劑。分別加入0、0.5、1、1.5 μg/mL SJMHE1。置于37 ℃、5% CO2的條件下培養4 d。

1.3.3流式細胞術檢測Th17細胞 分別取1×106個培養細胞用250 μL含10%胎牛血清的1640完全培養基重懸，加入1 μL佛波酯/離子霉素混合液和1 μL布雷非德菌素A/莫能霉素混合液，充分混勻，37 ℃、5% CO2培養箱孵育5 h。收集細胞置于1.5 mL離心管中，用100 μL PBS重懸。加入FITC標記的抗鼠CD4抗體0.5 μL，充分混勻，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌1遍。加入1 mL細胞破膜液，充分混勻，4 ℃避光孵育15 min，緩沖液洗滌1遍。將細胞重懸于100 μL緩沖液中，加入PE標記的抗鼠IL-17抗體0.6 μL，充分混勻，4 ℃避光孵育30 min，緩沖液洗滌2遍。將細胞重懸于300 μL緩沖液中，流式細胞術檢測Th17細胞(CD4+IL-17+)。實驗重復3次。

1.3.4流式細胞術檢測Treg細胞 分別取1×106個培養細胞置于1.5 mL離心管中，用100 μL PBS重懸。加入FITC標記的抗鼠CD4抗體0.5 μL，APC標記的抗鼠CD25抗體0.5 μL，充分混勻，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌1遍。加入1 mL細胞破膜液，充分混勻，4 ℃避光孵育30 min，緩沖液洗滌1遍。將細胞重懸于100 μL緩沖液中，加入PE標記的抗鼠FoxP3抗體1 μL，充分混勻，4 ℃避光孵育60 min，緩沖液洗滌2遍。將細胞重懸于300 μL緩沖液中，流式細胞術檢測Treg細胞(CD4+CD25+FoxP3+)。實驗重復3次。

1.3.5實時熒光定量PCR檢測視黃酸相關核孤兒受體γt(retinoic acid-related orphan receptor γt,RORγt)和FoxP3 mRNA 收集培養細胞，提取總RNA，測定總RNA含量。逆轉錄合成cDNA，逆轉錄反應條件設置：25 ℃ 5 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，進行1個循環。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內參對目的基因表達進行標準化。引物分別如下：GAPDH引物(序列號MQP027158)、RORγt引物(序列號MQP067542)、FoxP3引物(序列號MQP067272)。PCR反應條件設置：95 ℃ 30 s預變性，進行1個循環；95 ℃ 10 s變性，60 ℃ 30 s退火和延伸，進行40個循環。mRNA的相對表達量采用2-ΔΔCt比較法進行計算。實驗重復3次。

1.3.6哮喘小鼠模型的建立 將剩余的15只小鼠依據隨機數字法分為 PBS組、卵白蛋白(ovalbumin,OVA)組和OVA+SJMHE1組，每組5只。分別在第1、8和15天給予哮喘小鼠腹腔注射含50 μg OVA和2 mg 10%氫氧化鋁的混合溶液，同時正常對照小鼠腹腔注射等量PBS。從第22天開始，哮喘小鼠使用2% OVA溶液進行霧化，每日1次，每次30 min，持續至第28天結束，同時正常對照小鼠使用PBS進行霧化。造模成功的判斷標準為小鼠出現煩躁不安、呼吸急促、頭面部瘙癢、口唇發紺、前肢縮抬等陽性反應。此外，分別在第1、15和29天，給予哮喘小鼠腹腔注射含10 μg SJMHE1的多肽乳化劑。飼養小鼠至第36天。

1.3.7肺組織病理學分析 取小鼠左肺組織，用4%的甲醛固定，石蠟包埋并制成4 μm厚度切片。融蠟后分別置于二甲苯Ⅰ和Ⅱ中脫蠟，各10 min，等比例二甲苯和100%乙醇混合溶液浸泡 2 min，后置于100%、100%、80%乙醇中脫水，各5 min。蘇木精染液染色5 min后流水沖洗，1%鹽酸乙醇浸泡30 s后流水沖洗，1%伊紅染液染色30 s后流水沖洗。將切片分別置于95%、95%、100%、100%乙醇中脫水，各1 min，后置于二甲苯Ⅰ和Ⅱ中透明，各3 min。中性樹脂封片，在顯微鏡下觀察組織病理學改變。

1.3.8實時熒光定量PCR檢測IL-17A和IL-10 mRNA 取小鼠右肺組織，制備單細胞懸液。引物分別如下：GAPDH引物(序列號MQP027158)、IL-17A引物(序列號MQP032565)、IL-10引物(序列號MQP029453)。檢測方法與標題1.3.5相同。

2 結 果

2.1SJMHE1作用對Th17細胞和Treg細胞的影響 在一定濃度范圍內，隨著SJMHE1濃度的增加，Th17細胞的比例不斷降低，Treg細胞比例不斷升高，見圖1。不同SJMHE1濃度組Th17細胞和Treg細胞比例比較差異有統計學意義(P<0.01)，其中0.5、1和1.5 μg/mL SJMHE1組Th17細胞比例均低于0 μg/mL SJMHE1組(P<0.05)；1 μg/mL和1.5 μg/mL SJMHE1組Treg細胞比例高于0 μg/mL SJMHE1組(P<0.05)，0.5 μg/mL SJMHE1組Treg細胞比例與0 μg/mL SJMHE1組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同SJMHE1濃度作用下Th17細胞和Treg細胞比例比較

Th17：輔助性T細胞17；Treg：調節性T細胞；FoxP3：叉頭框蛋白P3

2.2SJMHE1作用對轉錄因子RORγt和FoxP3 mRNA表達水平的影響 不同SJMHE1濃度組轉錄因子RORγt和FoxP3 mRNA表達水平比較差異有統計學意義(P<0.05),其中1 μg/mL和1.5 μg/mL SJMHE1組RORγt mRNA均低于0 μg/mL SJMHE1組(P<0.05)，FoxP3 mRNA均高于0 μg/mL SJMHE1組(P<0.05)，0.5 μg/mL SJMHE1組與0 μg/mL SJMHE1組RORγt和FoxP3 mRNA表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同SJMHE1濃度作用下轉錄因子RORγt和FoxP3 mRNA表達水平比較

2.3肺組織病理學改變 PBS組小鼠肺部支氣管以及肺泡結構正常，上皮細胞排列整齊，管腔光滑，黏膜下無平滑肌增生。與PBS組相比，OVA組小鼠肺部支氣管管壁明顯增厚，管腔狹窄變形，黏膜下平滑肌增生明顯。肺泡間隔增多，支氣管周圍以及肺泡間質內出現大量的炎癥細胞浸潤。OVA+SJMHE1組小鼠肺部支氣管結構異常、炎癥細胞浸潤等病理學改變較OVA組明顯減輕。見圖2。

2a：PBS組；2b：OVA組；2c：OVA+SJMHE1組

2.4肺組織細胞因子IL-17A和IL-10 mRNA表達水平的改變 各組小鼠肺組織細胞因子IL-17A和IL-10 mRNA表達水平比較差異有統計學意義(P<0.05),其中OVA組IL-17A mRNA高于PBS組(P<0.05)，OVA+SJMHE1組低于OVA組(P<0.05)；OVA組IL-10 mRNA低于PBS組(P<0.05)，OVA+SJMHE1組高于OVA組(P<0.05)，OVA+SJMHE1組IL-17A和IL-10 mRNA與PBS組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠肺組織細胞因子IL-17A和IL-10 mRNA表達水平比較

3 討 論

現有研究認為，在過敏性或自身免疫性疾病的發病過程中，來自外界的病原體可與自身抗原形成競爭關系，從而緩解自身免疫性反應[8]。流行病學調查顯示，在蠕蟲感染的高發區，過敏性或自身免疫性疾病的發病率較低。因此，人們開始關注蠕蟲及其相關分子在疾病治療中的調節作用和機制[9]。為減少或避免蠕蟲及蠕蟲來源的免疫調節大分子在抗感染治療中引起的不良反應，研究者著力尋找精準的小分子物質，力求該小分子具有抗炎效應的同時能夠提高治療的安全性。例如，絲狀線蟲來源的小分子物質ES-62，現已被證實可以通過調節腸道微生物菌群和抑制與生態失調相關的慢性炎癥來保護腸道和胃黏膜[10]。同時它還可以有效改善類風濕關節炎病癥，抑制破骨細胞的形成[11]。旋毛蟲成蟲小分子提取物對小鼠過敏性哮喘有積極的預防和治療作用，主要表現為緩解由OVA引起的氣道炎癥反應，這與Th2細胞相關因子IL-4分泌的降低以及Treg細胞相關因子IL-10、轉化生長因子-β分泌的增加密切相關[12]。

本課題研究的多肽SJMHE1是一種新型免疫調節劑，多CD4+T細胞表位的特點使該分子易于在特異性免疫應答中發揮作用。SJMHE1能夠通過促進Treg細胞增殖并升高抗炎細胞因子IL-10和轉化生長因子-β的表達而有效抑制遲發性超敏反應。此外，SJMHE1還可以減輕膠原誘導性關節炎小鼠的炎癥反應和毒副反應，主要表現為炎癥細胞浸潤和軟骨破壞的減少，不引起肝、腎功能損傷和主要臟器的病理學改變。因此，具有抗炎效應和高安全性的小分子多肽SJMHE1具有廣泛的臨床應用前景。

有研究對哮喘患者體內CD4+T細胞的分化進行了探索，結果顯示，誘導Th17細胞分化的關鍵性細胞因子IL-1β和IL-6均呈高表達，轉錄因子RORγt、RORα、信號轉導及轉錄激活因子3以及干擾素調節因子4均參與Th17細胞的分化過程。同時，Th17細胞過表達IL-17A和IL-17F，刺激嗜酸粒細胞增多，加重中性粒細胞炎癥反應[13]。Treg細胞及其分泌產物IL-10、轉化生長因子-β則涉及Smad2/3相關信號通路的調控[14]。本研究在體外研究發現了SJMHE1對Th17、Treg細胞及其轉錄因子具有相反的調節作用，證實SJMHE1可以調控Th17/Treg細胞平衡。然后利用OVA誘導的哮喘小鼠模型進一步探討SJMHE1對過敏性哮喘的作用，結果顯示，SJMHE1治療顯著抑制了小鼠氣道炎癥細胞的浸潤，肺組織中促炎細胞因子IL-17A的分泌減少，同時抗炎細胞因子IL-10的分泌增加。

臨床研究證實，維持Th17/Treg細胞平衡在靶向免疫治療方面已取得顯著成效，多數已作為臨床上治療過敏性或自身免疫性疾病的候選方法[15-17]。因此，調節細胞信號通路的靶向治療是設計治療哮喘新藥的有效策略。目前已有多種生物分子和藥物成分通過靶向調節Th17/Treg細胞平衡對哮喘癥狀發揮抑制作用[18]。有研究顯示，在體外給予抗程序性細胞死亡受體1刺激可降低哮喘患者Th17細胞比例和RORγt mRNA表達，提高Treg比例和FoxP3 mRNA表達。在小鼠哮喘模型中，也進一步證實抗程序性細胞死亡受體1治療對Th17/Treg細胞平衡的調節作用[19]。黃淮芪可以通過調節細胞因子的分泌調控Treg/Th17細胞平衡，并改變哮喘小鼠體內轉錄因子FoxP3和RORγt mRNA的表達水平，從而發揮抑制哮喘發生發展的作用[20]。此外，長鏈非編碼RNA母系表達基因3作為一種內源性競爭性RNA，靶向miR-17/ROR 295t，調控哮喘患者Treg/Th17細胞平衡[21]。本課題研究結果與上述研究結果趨勢一致，為SJMHE1通過調控Th17/Treg細胞平衡緩解哮喘小鼠氣道炎癥提供了有力依據。未來將著重關注SJMHE1對相關靶基因的調控，明確其作用機制。

綜上所述，日本血吸蟲來源的小分子多肽SJMHE1具有抑制Th17細胞比例及其相關分子表達、促進Treg細胞比例及其相關分子表達的作用，可以通過調節Th17/Treg細胞平衡改善過敏性哮喘小鼠的氣道炎癥反應，為過敏性哮喘的治療提供了新的靶點和依據。