云南省1株基孔肯雅毒株全基因組序列測定及特征分析

陳瑤瑤,趙曉南，孫艷紅，張美玲，周潔楠

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)是披膜病毒科甲病毒屬的單股正鏈RNA病毒，主要通過白紋伊蚊和埃及伊蚊叮咬傳播[1]。1952年，在坦桑尼亞首次檢測到CHIKV[2]，隨后在烏干達和許多其他撒哈拉以南非洲國家均發現了CHIKV，在過去的5年里，更是以驚人的速度擴散到亞洲、非洲、歐洲和美洲的100多個國家，成為日益嚴重的全球健康威脅[3]。1986年云南省從蝙蝠腦組織中分離出一株CHIKV毒株[4]，這是我國首次分離得到CHIKV毒株，2008年在廣東出現了首例輸入性基孔肯雅熱病例[5]，隨后在我國的其他地方不斷出現輸入性病例和本地疫情[6-8]。云南省位于中國西南邊陲，與多個東南亞國家接壤，經濟貿易往來及國際間旅行日益頻繁, 存在極大輸入性風險，再加上豐富多樣的氣候類型，適合伊蚊生存繁殖的自然地理環境[9]，云南省基孔肯雅熱流行風險正在加劇。2019年6月，通過流行病學調查及實驗室檢測，云南省確診1例基孔肯雅熱輸入性病例，本研究通過對CHIKV進行分離培養和全基因組測序，分析病毒遺傳進化趨勢及氨基酸位點變異情況，為云南省防控基孔肯雅熱提供科學依據。

1 材料與方法

1.1標本來源 2019年6月27日采集得到1名緬甸仰光飛抵昆明長水機場的旅客血清，送至云南省疾病預防控制中心排查基孔肯雅熱。

1.2核酸提取及real-time RT-PCR檢測 采用江蘇碩世全自動核酸提取儀和病毒核酸提取試劑盒(貨號：SDK60104)進行核酸提取，病毒核酸檢測使用基孔肯雅病毒檢測試劑盒(江蘇碩世，貨號：JC40104)，具體反應體系和反應條件參照試劑盒說明書。

1.3病毒分離培養 將患者血清接種于80%單層非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)中，置于37 ℃、5% CO2培養箱吸附2 h后，加入含有2%胎牛血清、7.5%碳酸氫鈉及雙抗的維持液(維持液基質DMEM)，繼續放入培養箱進行培養。每日觀察病變情況。收獲盲傳第2代72 h培養物進行后續實驗。

1.4測序引物 設計參考相關文獻[8]，合成基孔肯雅全基因組擴增引物，對CHIKV進行分段擴增，以便后續測序。引物由昆明擎科生物公司合成。

1.5全基因組測序 使用TAKARA One Step RT-PCR試劑盒(貨號：RR057)對病毒核酸進行擴增，反應體系：2×1 step Buffer 12.5 μL，1 step Enzyme mix 1 μL，Forward Primer(10 μmol/L)1.5 μL，Reverse Primer(10 μmol/L)1.5 μL，無酶水6 μL，模板2.5 μL，反應體系總體積25 μL。反應程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，共30個循環，72 ℃再延伸7 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用凝膠成像系統觀察結果，陽性擴增產物送至昆明擎科生物公司進行測序。

1.6序列拼接和系統進化發生樹構建及分析 使用DNAStar 7.1軟件對測序結果進行拼接，在NCBI上下載參考株序列，通過Mega5.0軟件對序列進行比對和系統發生樹構建。采用Neighbor-joining法構建進化樹，bootstrap值設置為1 000。

2 結 果

2.1流行病學調查 患者趙某，男，43歲，云南人。在緬甸經商，經常往返于昆明-仰光。患者于2019年1月前往仰光，2019年6月26日返回昆明，期間當地有蚊傳疾病散發，自述有蚊蟲叮咬史。

2.2Real-time RT-PCR檢測 病例血清標本核酸檢測顯示CHIKV陽性，Ct值為15.73。

2.3病毒分離鑒定 將1代細胞培養物接種細胞后，觀察細胞病變情況，細胞逐漸融合、堆聚，在72 h后病變達到80%，將細胞板置于-70 ℃冰箱。反復凍融2次，取200 μL融解后的培養物進行核酸提取及病毒核酸檢測。Real-time RT-PCR結果顯示CHIKV陽性，Ct值為9.14。見圖1。

圖1 CHIKV感染Vero細胞病變情況Fig.1 Cytopathogenic effects after Vero cells infection with CHIKV

2.4全基因組測序 對測序數據進行拼接處理后獲得CHIKV全基因組序列，命名為YN0627，全長為11 586 nt，其基因結構符合CHIKV的基因特征，基因組內包含兩個完整的編碼框，分別編碼4個非結構蛋白(nsP1-nsP2-nsP3-nsP4)和5個結構蛋白(C-E3-E2-6K-E1)，兩個編碼框之間有一個非編碼的連接區，長度為65個核苷酸。非結構蛋白編碼區共包含7 425個核苷酸，編碼2 474個氨基酸；結構蛋白編碼區共包含3 747個核苷酸，編碼1 248個氨基酸，均不存在堿基的插入和缺失。5′端起始的76個核苷酸和3′端273個核苷酸為非編碼區。

2.5全基因組進化分析 通過對YN0627的全基因組以及編碼區進行BLAST N檢索，得到序列相似度最高的均為CHIKV。將YN0627的基因組編碼區與選取的參考序列進行多重比對，系統進化分析顯示YN0627與來自泰國的MN630017、MK468801、來自中國的MH400249、來自孟加拉的MF773566等毒株關系密切，并與東中南非洲遺傳譜系(East, Central and South African Lineage, ECSA)的其他流行株聚集在一起，顯示出緊密的進化相關性，見圖2。與ECSA譜系內的參考序列進行多重比對，YN0627的編碼區與參考序列相比，核苷酸同源性為85.24%～99.96%，氨基酸同源性為95.34%～99.97%；與非洲原型株S27比較，核苷酸同源性為97.33%，氨基酸同源性為98.53%。

圖2 CHIKV-YN0627系統進化樹Fig.2 Phylogeny of CHIKV-YN0627

2.6基因位點分析 在YN0627的 5個結構蛋白的編碼區域中，一共觀察到28個氨基酸變異位點。未觀察到E1中的對白紋伊蚊的適應性突變A226V，但是有E1：D284E、E1：K211E、E2：V264A和E2：I211T突變，其他一些位點，例如可能影響氨基酸pH值的E2：K252Q[5]沒有被觀察到；E2蛋白上兩個重要糖基化抗原位點263N和345N呈高度保守[10]，見表1。

3 討 論

系統進化分析通過不同的地理位置將CHIKV分為3個遺傳譜系：東中南非洲(ESCA)譜系、亞洲(Asian)譜系和西非(West Africa)譜系。從本研究的系統進化分析結果來看，YN0627與東南亞各國毒株關系密切，屬于ESCA遺傳譜系，與流行病學調查資料結果相一致，是來自東南亞國家緬甸的輸入性病例。中國分離得到大部分基孔肯雅毒株都屬于輸入型的，因此國內各毒株間進化關系并不是特別密切，但是我們依舊需要對該病毒進行密切關注和更加深入的研究，特別應該關注能夠增強病毒毒力和適應性突變的位點。

表1 CHIKV YN0627結構蛋白氨基酸變異位點分析Tab.1 Amino acid variation sites in the structural protein of CHIKV-YN0627

CHIKV共編碼4個非結構蛋白和5個結構蛋白，非結構蛋白不會包裝到最終病毒體中，結構蛋白才是宿主體液免疫應答和大多數疫苗的關鍵靶點[11]，因此本研究著重對結構蛋白的氨基酸變異位點進行分析。分析結果發現YN0627沒有E1：A226V的突變，而觀察到了E1：K211E、E1：D284E、E2：V264A和E2：I211T突變。E1：A226V突變在2005年首次被發現，該位點的突變能夠提高CHIKV在白紋伊蚊中的適應性[12]，在東南亞白紋伊蚊為優勢種群的多個地區，都分離到了有E1：A226V突變的CHIKV毒株[13]。但是有研究證明，在E1：226A的基礎上引入E1：K211E和E2：V264A的突變，能使CHIKV在感染埃及伊蚊14天后，其體內的滴度成倍數增長：在中腸中增加13倍，在腿和翅膀中增加15倍，在唾液中增加62倍[14]。有學者在云南省邊境地州開展蚊媒媒介的相關監測和研究，結果表明，白紋伊蚊在云南省內分布廣泛，但是近年來埃及伊蚊的分布區域呈現出逐漸擴大的趨勢，埃及伊蚊孳生優勢較白紋伊蚊明顯，有取代白紋伊蚊成為優勢種及不斷向周邊區域擴散和定殖的分布趨勢[15-16]，綜合分離株YN0627中存在E1：226A的基礎上的E1：K211E和E2：V264A，文獻實驗數據顯示這些突變能夠提高CHIKV對埃及伊蚊的適應性，提示云南省應當加強對CHIKV的監測和研究。

在YN0627中還觀察到了E1：D284E和E2：I211T突變，E1：D284E對膜融合和病毒體的裝配有很重要的作用[12]。另有研究發現，E2：I211T突變在最近發現的ESCA譜系中普遍存在，這表明E2：I211T的突變對于CHIKV適應ECSA流行區域普遍存在的某些特定條件非常重要[17]。我們還觀察到了結構蛋白上的其他變異如C：P23S，C：V27I，E3：I23T，6K：V8I，E1：M269V等等，但是這些位點對病毒功能的影響尚不清楚。

基于我國的基孔肯雅熱疫情一直以輸入性的散發病例為主，國內人群缺乏免疫力，普遍易感，且目前尚無有效的疫苗和抗病毒藥物，做好對CHIKV感染源頭的防控，即防蚊滅蚊工作至關重要。還需加強重點人群宣教，到高風險地區旅居的人應采取基本的防蚊措施，返回時如感不適，就醫時應主動提供自身旅居史。同時需加強醫務人員培訓，提高醫務人員對疾病的識別能力和對傳染病的敏感性，防止本地病例的產生。

利益沖突：無