隴西縣牛巴貝斯蟲病的流行病學調查

劉玉海

（甘肅省隴西縣畜牧技術服務中心 碧巖鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，甘肅 隴西 748107）

巴貝斯蟲?。˙abesiosis），舊稱焦蟲病，是由巴貝斯屬的原蟲寄生于宿主動物紅細胞內引起的一類蜱傳性血液寄生蟲病，感染該病的動物常表現出的臨床癥狀有高熱、貧血、黃疸、血紅蛋白尿，嚴重時引起死亡。病理剖檢具有臨床癥狀的動物，可觀察到患病動物的肺部、腦部、腎臟等實質器官毛細血管中的紅細胞呈線狀或集落狀凝集，因此該病可影響這些實質性器官的正常功能。在世界范圍內，引起牛巴貝斯蟲病的主要病原有牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲、分歧巴貝斯蟲、大巴貝斯蟲、雅氏巴貝斯蟲、卵形巴貝斯蟲、隱藏巴貝斯蟲和東方巴貝斯蟲等8種[1]，其中在我國分離并流行的牛巴貝斯蟲有5種，分別是牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲、卵形巴貝斯蟲、大巴貝斯蟲和巴貝斯蟲未定種[2]。

牛巴貝斯蟲病給畜牧業(yè)帶來了嚴重危害，其中牛巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲分布最廣，發(fā)病率和死亡率最高，危害最為嚴重，這兩者是牛巴貝斯蟲病急性爆發(fā)的主要病原，且共享同一種傳播媒介—牛蜱屬的蜱。同時，這兩種巴貝斯蟲經常使動物處于混合感染狀態(tài)，患病動物表現出嚴重的臨床癥狀。鑒于此病的危害，國內外一些研究學者建立了相應的檢測方法，如分子生物學方法、血清學方法。

分子生物學方法包括針對不同靶基因建立的常規(guī)PCR方法、恒溫擴增技術LAMP等，但該方法只適合急性感染狀態(tài)的?；蛟谂ｓw內能檢測到病原。對慢性感染狀態(tài)或急性感染過后帶蟲狀態(tài)的牛在體內檢測不到病原或蟲體的情況而言，尋找一種合適的檢測方法顯得尤為重要。血清學方法檢測動物體內的抗體，只要感染過本病，體內有抗體產生，該方法就適合。研究表明，體內抗體的存在要很長時間，甚至長達一年，為此建立一種適合的血清學方法顯得尤為重要。

為了診斷該病，已有學者建立了檢測牛巴貝斯蟲病的間接免疫熒光抗體試驗（IFAT）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等不同的血清學方法。但在實際臨床檢測中，間接免疫熒光抗體試驗（IFAT）敏感性低，檢測結果容易受人為因素影響，所以在大規(guī)模血清樣品的檢測時不適用。與該方法相比，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）克服了間接免疫熒光抗體試驗（IFAT）的缺點，檢測的特異性和敏感性較高，檢測結果比較客觀，且適合高通量樣品的檢測[3]。

除上述分子生物學方法和血清學方法之外，病原學顯微鏡檢查也常作為一種輔助的經典檢測方法，該方法常用在急性感染的牛或在康復后牛的血液涂片中檢測到牛巴貝斯蟲，但該方法對檢測人員的專業(yè)技術要求比較高。

縱觀檢測牛巴貝斯蟲病的幾種方法，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）更具優(yōu)勢，抗原的來源是決定該方法優(yōu)越性的關鍵。OIE通用的檢測抗原為蟲體抗原，但在牛巴貝斯蟲病ELISA檢測中，蟲體抗原為粗抗原，經常發(fā)生種間交叉反應，且該抗原的來源有限，純化該蟲體抗原需要感染除蜱牛，純化過程復雜且純化量少，耗費人力、物力、財力。為了克服這一難點，本研究用已建立的重組牛巴貝斯蟲棒狀體相關蛋白（rhoptry-associated protein，RAP-1）作為ELISA診斷抗原，該抗原是經大腸桿菌體外培養(yǎng)，原核表達獲得，純化過程簡單，抗原純度和濃度均較高，且易大量繁殖純化。為此用牛巴貝斯蟲重組蛋白作為診斷抗原，對隴西縣3個不同牛場黃牛群中牛巴貝斯蟲感染情況進行調查，對2016—2017年采集的血樣用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）進行牛巴貝斯蟲病的血清學調查，試驗過程與結果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

牛巴貝斯蟲重組蛋白Bo-RAP-1抗原，惠存在蘭州獸醫(yī)研究所家畜寄生蟲病研究室。辣根過氧化物酶標記的兔抗牛酶標二抗，采購于美國Sigma公司。其他所需試劑和耗材均是國產，購自不同的生產供應商。

188份黃牛血清均采自隴西縣3個不同地區(qū)的牛場。采血時保定牛只，頸靜脈采集血樣，采集完成后帶回實驗室，放置在37℃溫箱1 h，然后放置在4℃冰箱6 h，等析出淡黃色血清后，3 000 rpm離心10 min，收集上清，放置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ELISA試驗方法

1.2.1 包被抗原 純化的牛巴貝斯蟲病棒狀體蛋白Bo-RAP-1作為診斷抗原，按照0.2 μg/ml劑量加到包被液中（50 mm碳酸鹽緩沖液，pH9.6），輕輕混勻后用排槍加到96孔ELISA酶標板中，每孔加樣100 μl，放置4℃條件下13～15 h。

1.2.2 封閉 甩掉酶標板中的包被液，將酶標板至于ELISA專用洗板機中，用含有0.05%Tween-20的PBST洗滌液洗滌3次后，在干凈吸水紙上拍干板子，用含5%脫脂乳的封閉液進行封閉，用排槍每孔加200 μl，放置在37℃條件下封閉1 h。

1.2.3 加血清 取出酶標板，甩掉酶標板中的封閉液，同1.2.2的方法洗滌后，用PBST將188份血清按1∶20稀釋，同時陰陽性對照血清也按1∶20稀釋，每個樣品平行加到酶標板的兩個豎排孔中，每孔各加100 μl，輕搖混勻，在37℃條件下放置1 h。

1.2.4 加酶標二抗 取出酶標板，甩干多余液體，同1.2.2的方法洗滌3次后，用PBST將辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG抗體（Sigma，USA）按1∶10 000倍稀釋，稀釋后每孔加100 μl，輕搖混勻，在37℃條件下放置1 h。

1.2.5 顯色 取出酶標板，甩干多余液體，同1.2.2的方法洗滌3次后，每孔加100 μl TMB底物液顯色，用遮光紙覆蓋避光，在37℃條件下放置10 min。

1.2.6 終止 取出酶標板，移去遮光紙，在每個反應孔中加入100 μl 2%H2SO4溶液，用來終止反應，此時肉眼可見顏色由藍色變?yōu)辄S色。

1.2.7 讀數 將加了終止液的酶標板置于專用酶標儀上，測定光吸收值（OD450nm）。

1.2.8 判定標準 樣本OD450nm值≥0.4時判為陽性；OD450nm值＜0.4時判為陰性。

2 結果

在3個不同的牛場中，牛巴貝斯蟲病均存在不同程度的血清學陽性狀況，陽性血清的感染率為21.4%～30.2%（見表1）。

表1 2016—2017年隴西縣牛巴貝斯蟲病血清學檢測結果

3 討論與結論

牛巴貝斯蟲病是一種對家畜危害十分嚴重的血液寄生蟲病，每年4—10月是該病的傳播媒介頻繁活動時間，在這期間，牛群感染本病的風險也最高，給養(yǎng)牛業(yè)造成了極大的損失。

隴西縣屬干旱半干旱區(qū)，在牛巴貝斯蟲和泰勒蟲等血液原蟲病的防疫上目前尚未有好的方法。這一地區(qū)由于媒介蜱的存在，每年都流行牛巴貝斯蟲病，阻礙了隴西縣畜牧業(yè)的發(fā)展。因此，應阻斷媒介蜱的傳播，制定家畜原蟲病防疫計劃，采取滅蜱等綜合預防措施，以減少畜牧業(yè)的損失。