MiR-195-5p對食管鱗癌細胞放射敏感性的影響及作用機制研究

張 碟，劉祥賀，霍苗苗，劉 梅，徐寧志，朱紅霞

(國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院，分子腫瘤學國家重點實驗室，北京 100021)

食管癌是世界高發惡性腫瘤之一，食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是食管癌最主要的組織學類型，在發展中國家更為常見，東亞是高發地區，主要分布在中國。手術切除是食管鱗癌患者的首要治療方法，并提供了治愈的最佳機會，但由于大多數食管鱗癌患者確診時已屬晚期，伴有遠處或淋巴結轉移，失去了手術機會，因此食管癌患者的總體預后不理想，5 年生存率僅為17%左右。對于不能手術切除的食管癌患者，放射治療可以顯著提高患者生存，已經成為一種重要的治療手段。然而食管鱗癌對放射治療的敏感性并不理想，而且對于放射的抵抗會導致治療失敗，因此在臨床應用方面迫切需要提高放射敏感性的方法，了解食管癌放射抵抗的相關機制。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約為22個核苷酸的內源性非編碼小RNA，通過與其靶基因mRNA 的 3′端非翻譯區(the 3′ untranslated region，3′UTR)結合，抑制靶基因mRNA的翻譯或穩定性，參與基因表達調控。最近的研究表明，miRNA在輻射誘導的基因表達、細胞信號事件和損傷反應通路的調控中發揮著重要作用，miRNA已被證明可以調節輻射敏感性，可能作為評估和監測腫瘤放射敏感性以及調節放療反應的候選分子。近年來，許多研究報道了不同類型細胞的miRNA在放療時表達的變化，以及各種miRNA 在細胞輻射敏感性中的具體作用。MiR-195是miR-15/107家族成員，在不同類型的腫瘤中發揮促癌或者抑癌作用。MiR-195 在食管癌患者腫瘤組織中的表達顯著降低，提示miR-195可能在食管癌的發生發展中發揮抑癌基因的作用。然而關于miR-195-5p與食管癌關系的研究仍較少。本研究旨在探討miR-195-5p對食管鱗癌細胞放射敏感性的影響及其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系和主要試劑

食管鱗癌細胞系KYSE510、KYSE150 由日本Shimada Y 博士惠贈。RPMI 1640 培養基購自北京細工公司，胎牛血清購自ExCell Bio 公司，RIPA buffer、抗survivin抗體購自CST公司，抗GAPDH抗體購自 Proteintech 公司，BCA Protein Assay Kit 購自Thermo Scientific 公司，Trizol 試劑及 Lipofectamine3000 轉染試劑購自Invitrogen 公司，PrimeScriptRT Master Mix 反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa 公司，riboSCRIPT Reverse Transcription Kit 購自銳博(廣州)生物技術有限公司，Power SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒購自 Applied Biosystems 公司，Enlight顯色劑購自Engreen Biosystem 公司。內參GAPDH 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。MiR-195-5p 和 U6 的 Bulge-LoopTM RT 引物，miR-195-5p 的類似物，拮抗物及各自的陰性對照片段均由銳博(廣州)生物技術有限公司設計合成。Cell Counting Kit-8 及Annexin V，FITC 凋亡檢測試劑盒購自東仁化學科技(上海)有限公司。BeyoClickEdU-594 細胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。Dualluciferase reporter assay system(E1960)試劑盒購自Promega 公司。BIRC5 3′ UTR 報告基因質粒及 pGL3陰性對照質粒購自上海吉凱基因化學技術有限公司。

1.2 細胞培養及放射線照射

用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的 RPMI 1640 培養液培養 KYSE510 和KYSE150 細胞，并置于37 °C、CO體積分數為5%的恒溫培養箱內，每隔1～2 d 換液，細胞生長至匯合度為80%左右時，使用0.05%的胰蛋白酶消化細胞，傳代培養。將處于對數生長期的細胞消化計數，制成適宜濃度的單細胞懸液后接種于孔板中，待細胞貼壁后，采用X 射線(MultiRad)以源皮距SSD=100 cm，按3 Gy/min 的劑量率對細胞進行不同劑量(4 或8 Gy)的照射，以未照射細胞為對照。

1.3 細胞轉染

將KYSE510和KYSE150細胞按3×10個/孔接種于6孔板中培養24 h，細胞生長至匯合度為70%～80%時進行轉染，轉染前1 h 更換不含抗生素的RPMI 1640培養液培養，采用Invitrogen 公司的Lipofectamine3000進行細胞轉染，具體操作按說明書進行。分別將4 μL 20 μmol/L 的miR-195-5p類似物、miR-195-5p拮抗物或陰性對照片段加入120 μL Opti-MEM中稀釋混勻，室溫靜置5 min，同時用120 μL 的Opti-MEM稀釋4 μL轉染試劑Lipofectamine3000，然后分別將稀釋后的miR-195-5p 類似物、拮抗物或陰性對照片段加入到稀釋后的Lipofectamine3000 試劑中輕輕吹打混勻，室溫靜置15 min，最后逐滴均勻加入到孔板中，37 ℃培養24 h后進行后續實驗。

1.4 細胞分組

研究RNA 表達水平時，對KYSE510 和KYSE150細胞進行8 Gy 的X 射線照射，另以未照射細胞為對照，于照射后24 h 檢測兩組細胞中miR-195-5p 的表達水平；將轉染miR-195-5p 類似物、拮抗物或相應陰性對照片段的KYSE510 細胞用8 Gy 的X 射線照射，于照射后24 h 檢測各組細胞中survivin mRNA 的表達水平。

研究蛋白表達水平時，對KYSE510和KYSE150細胞進行8 Gy 的X 射線照射，另以未照射細胞為對照，于照射后不同時間(1、6、12、24 和72 h)檢測兩組細胞中survivin 蛋白的表達變化；將轉染miR-195-5p 類似物、拮抗物或相應陰性對照片段的KYSE510 和KYSE150 細胞用8 Gy 的X 射線照射，于照射后24 h檢測各組細胞中survivin蛋白的表達水平。

1.5 CCK-8法檢測細胞生長情況

將KYSE510 或KYSE150 細胞分別接種于96 孔板中，每孔1 000個，置于37 ℃、CO體積分數為5%的恒溫培養箱中培養12 h 后，分別用4 Gy 或8 Gy 的X 射線照射細胞，以未照射細胞為對照，繼續培養4 d，吸去培養液，加入CCK-8 溶液，用酶標儀分別在照射后1～4 d每天檢測1次在450 nm處的吸光度值

D

(450)。

1.6 實時熒光定量PCR 法檢測細胞miR-195-5p 和survivin mRNA表達水平

用Trizol 裂解法提取各組細胞總RNA，對于mRNA使用PrimeScriptRT Master Mix逆轉錄試劑盒合成cDNA，對于miRNA 使用riboSCRIPT Reverse Transcription Kit 進行逆轉錄合成cDNA。定量PCR 使用 Power SYBR Green PCR Master Mix 按照 20 μL 體系(10 μL Mix、1 μL 正向引物、1 μL 反向引物、1 μL cDNA 和 7 μL HO)加樣。以 GAPDH 作為 mRNA的內參基因，以U6作為miRNA的內參基因。qPCR擴增程序為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸 30 s，共 40 個循環。用 2法計算mRNA 的相對表達水平。mRNA 引物由生工公司合成，其序列如下：survivin，正向引物5′-AGGACCA CCGCATCTCTACAT-3′，反向引物 5′-AAGTCTGGCT CGTTCTCAGTG-3′；GAPDH，正向引物5′-GTGAAG GTCGGAGTCAACGG-3′，反向引物 5′-CTCCTGGAA GATGGTGATGGG-3′。

1.7 Western blot檢測survivin蛋白表達水平

用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，使用BCA蛋白檢測試劑盒進行定量，電泳分離后運用濕轉法將蛋白質轉移到NC 膜上。用抗survivin 抗體(1∶1 000 稀釋)4 ℃孵育過夜，顯色后使用化學發光成像儀曝光。

1.8 Incucyte實時動態活細胞監測

將轉染miR-195-5p 類似物、拮抗物或陰性對照片段24 h 后的KYSE510 細胞接種于96 孔板中，每孔4 000個，24 h后用8 Gy的X射線照射細胞，另設未照射細胞為對照。繼續培養72 h，用Incucyte S3監測細胞的實時動態，每3 h 記錄一次細胞的生長狀態。用細胞生長匯合度衡量細胞數量，匯合度低表示細胞數量少，而匯合度高則代表細胞數量多。

1.9 EdU摻入實驗

將KYSE510 細胞按 3×10個/孔接種于 6 孔板中培養24 h，分別轉染miR-195-5p 的類似物和陰性對照片段，24 h 后將細胞消化計數，以每孔2 000 個細胞接種于96 孔板中培養24 h 后，用8 Gy 的X 射線照射細胞，另設未照射細胞為對照，繼續培養細胞5 d后，使用BeyoClickEdU-594細胞增殖檢測試劑盒染色。用高內涵篩選儀器(Operetta)進行熒光檢測。EdU陽性細胞/Hoechst 陽性細胞比例代表細胞的增殖能力，比值大代表增殖能力強，比值小代表增殖能力弱。

1.10 克隆形成實驗

將轉染miR-195-5p 類似物、拮抗物或相應對照片段24 h 后的KYSE510 細胞接種于6 孔板中，每孔500個細胞，培養24 h后，用4 Gy X射線照射，另設未照射細胞為對照，孵育14 d后，固定染色，顯微鏡下計數＞50個細胞的克隆數，計算克隆形成率。

1.11 流式細胞術檢測細胞凋亡率

對轉染miR-195-5p 類似物或陰性對照片段24 h后的KYSE510 細胞用8 Gy 的X 射線照射，另設未照射細胞為對照，繼續培養7 d 后用凋亡檢測試劑盒標記Annexin V-FITC 和碘化丙錠(PI)，進行流式細胞術檢測，將Annexin V-FITCPI和Annexin V-FITCPI兩個象限的細胞占總細胞數的比例相加，即為細胞凋亡率。

1.12 雙熒光素酶報告基因實驗

將KYSE150 細胞接種于24 孔板中，每孔80 000個細胞，培養24 h后，用Lipofectamine3000瞬時共轉染20 pmol miR-195-5p 類似物或陰性對照片段，以及 200 ng BIRC5 3′ UTR 報告基因質粒或 pGL3 陰性對照質粒。轉染24 h后，各轉染組細胞用8 Gy的X射線照射，另設未照射細胞為對照，48 h 后裂解細胞，根據說明書，采用雙熒光素酶報告檢測系統(Promega)測定熒光素酶活性。

1.13 統計學分析

各實驗均進行3 次重復。統計分析采用GraphPad Prism 7 軟件，照射組、未照射組；miR-195-5p 類似物組、拮抗物組及陰性對照組細胞間各種指標差異的比較，采用

t

檢驗(Student's

t

test)，以

P

＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 X 射線照射后食管鱗癌細胞的生長情況及miR-195-5p和survivin蛋白的表達

食管鱗癌細胞KYSE510 和KYSE150 經4 和8 Gy的X射線照射后，CCK-8實驗檢測其生長情況，結果見圖1，兩株細胞的生長均受到明顯抑制。

圖1 CCK-8法檢測食管鱗癌細胞接受X射線照射后的生長情況

KYSE510 和 KYSE150 細胞經過 8 Gy X 射線照射后24 h，qPCR檢測miR-196-5p的表達水平，結果見圖2，與未照射組細胞相比，兩株照射組細胞中miR-195-5p的表達水平顯著均下降(

P

＜0.05或0.01)。

圖2 qPCR檢測食管鱗癌細胞接受8 Gy X射線照射后miR-195-5p的表達水平

KYSE510 和 KYSE150 細胞經過 8 Gy X 射線照射后 1、6、12、24、72 h，Western blot 檢測 survivin 蛋白的表達水平，結果見圖3，顯示KYSE510 細胞在照射后12、24、72 h，KYSE150 細胞在照射后24 h，survivin 蛋白的表達水平均高于未照射組細胞(均為

P

＜0.01)。

2.2 MiR-195-5p影響食管鱗癌細胞的放射敏感性

Incucyte實時動態活細胞監測結果見圖4，與陰性對照組相比，轉染miR-195-5p 類似物組的KYSE510細胞增殖速度減慢；經8 Gy X 射線照射后，轉染miR-195-5p類似物組細胞增殖速度顯著降低。計算同一時間點相同處理的照射組細胞匯合度與未照射組細胞匯合度的比值，可表示細胞經X射線照射后的相對存活率(圖4B)，結果顯示轉染miR-195-5p 類似物組KYSE510細胞的相對存活率較陰性對照組顯著降低。

EdU摻入實驗結果見圖5，顯示經8 Gy X射線照射后轉染miR-195-5p 類似物組KYSE510 細胞EdU 陽性率低于類似物對照組(

P

＜0.05)，而轉染miR-195-5p拮抗物組KYSE510細胞EdU陽性率顯著高于拮抗物對照組(

P

＜0.01)。

圖3 Western blot檢測食管鱗癌細胞接受8 Gy X射線照射后survivin蛋白的表達情況

圖4 轉染miR-195-5p類似物組KYSE510細胞經X射線照射后的增殖和存活情況

圖5 經X射線照射后轉染miR-195-5p類似物組、拮抗物組KYSE510細胞的增殖情況

克隆形成實驗結果見圖6，顯示轉染miR-195-5p類似物組KYSE510 細胞經4 Gy X 射線照射后的克隆形成率顯著低于類似物對照組(

P

＜0.01)，而轉染miR-195-5p拮抗物組KYSE510細胞經X射線照射后的克隆存活率則高于拮抗物對照組(

P

＜0.01)。

圖6 經X射線照射后轉染miR-195-5p類似物組、拮抗物組細胞的克隆形成能力

流式細胞術檢測結果見圖7，顯示經8 Gy X射線照射后轉染miR-195-5p 類似物組KYSE510 細胞的凋亡率較陰性對照組顯著升高(

P

＜0.01)。

圖7 經X射線照射后轉染miR-195-5p類似物組細胞的凋亡情況

2.3 MiR-195-5p靶向調控survivin蛋白的表達

通過TargetScan Human 網站預測人BIRC5 3′UTR 的 95～101 nt 為 miR-195-5p 的假定結合位點(圖8A)， 在 TCGA 數 據 庫 中 ， miR-195-5p 與 survivin mRNA 的表達水平在食管癌中呈負相關(

P

＜0.01，圖8B)。qPCR 實驗結果顯示X 射線照射后24 h，與陰性對照組相比，轉染miR-195-5p 類似物組KYSE510 細胞中survivin mRNA 表達水平顯著下降(

P

＜0.01)，而轉染miR-195-5p 拮抗物組的KYSE510 細胞中survivin mRNA 水平顯著升高(

P

＜0.05，圖 8C)。Western blot 實驗結果顯示，與相應的對照組比較，轉染miR-195-5p類似物組KYSE510 和KYSE150 細胞在接受8 Gy X 射線照射后24 h，survivin 的表達受到抑制，而轉染miR-195-5p 拮抗物組細胞經照射后則會促進survivin的表達(圖8D)。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，在KYSE150 細胞中過表達miR-195-5p 能夠抑制BIRC5 3′ UTR的熒光素酶活性(

P

＜0.01，圖8E)。以上結果表明，在食管鱗癌細胞中，miR-195-5p能夠靶向抑制survivin的表達。

3 討 論

放射抵抗被認為是放療后局部失敗和腫瘤復發的重要原因，有證據表明，miRNAs 調節介導輻射反應的關鍵細胞信號通路，有可能作為新的治療策略的開發目標來克服腫瘤的輻射抗性。越來越多的證據表明miRNAs 可以影響細胞對輻射的反應。Lv 等研究證明輻射可通過上調肺癌細胞中miR-155的表達，誘導己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)高表達及糖酵解增強，導致肺癌細胞的放射抵抗。Chen 等研究表明miR-18a-5p 可通過下調ATM 和HIF-1α的表達，增強肺癌細胞和CD133干細胞的放射敏感性。然而miRNA關于食管癌放射敏感性的研究還比較少。

圖8 食管鱗癌細胞中miR-195-5p靶向調控survivin的表達

MicroRNA 可以作為癌基因或抑癌基因，通過靶向腫瘤相關基因在食管癌的發生發展過程中發揮作用。研究發現miR-195 在多種惡性腫瘤中的表達均下調，包括乳腺癌、胃癌、肝癌、膀胱癌和腎上腺皮質癌等。MiR-195在肺癌中表達明顯下調，miR-195的異位表達能顯著抑制肺癌細胞的增殖和侵襲能力，并且在裸鼠異種移植模型中miR-195也可以抑制腫瘤的生長。很多研究發現，與正常食管組織相比，miR-195 在食管鱗癌細胞中的表達顯著降低，并且過表達miR-195-5p 可以抑制食管鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。

非小細胞肺癌細胞接受放射線照射后miR-195的表達水平明顯降低，過表達miR-195可通過抑制細胞增殖和誘導凋亡來增強非小細胞肺癌的放射敏感性。本研究結果顯示，食管鱗癌細胞接受放射線照射后miR-195-5p 的表達水平降低，轉染miR-195-5p類似物組的細胞存活率較陰性對照組顯著降低(

P

＜0.01)，凋亡率較陰性對照組顯著升高(

P

＜0.01)，而轉染miR-195-5p 拮抗物組的細胞存活率較陰性對照組升高(

P

＜0.01)，表明過表達miR-195-5p 能通過抑制細胞增殖和誘導凋亡來增強食管鱗癌的放射敏感性。本研究結果證明miR-195-5p 也可通過抑制細胞增殖和誘導凋亡增強食管鱗癌細胞的放射敏感性。生物信息學預測表明，miRNAs 調控著人類基因組中大約30%基因的表達。miRNA 與多種生物學功能和病理過程密切相關，包括細胞增殖、分化、凋亡和自我更新。為探討放射線照射抑制miR-195-5p導致放射拮抗的分子機制，需要進一步尋找miR-195-5p所調控的基因。Itesako等的研究首次證明survivin可能受膀胱癌細胞中miR-195/497 簇的調控，Yu 等的研究證明miR-195可直接靶向survivin誘導非小細胞肺癌的凋亡和衰老。本研究的分析提示TCGA 數據庫中miR-195-5p 與BIRC5 mRNA 表達水平在食管癌中呈負相關，并且在BIRC5 3′ UTR中有miR-195-5p的結合位點。進一步研究結果顯示，食管鱗癌細胞接受放射線照射后，miR-195-5p 表達下降，而survivin 的蛋白表達水平顯著升高。過表達miR-195-5p 可以抑制survivin 的mRNA 和蛋白表達水平，抑制miR-195-5p則survivin的mRNA和蛋白表達水平均升高。在基因轉錄水平過表達miR-195-5p能夠抑制BIRC5 3′ UTR的熒光素酶活性(

P

＜0.05)，而在細胞經受X射線照射后這一抑制作用會顯著增強(

P

＜0.01)。這些結果證明放射線照射抑制miR-195-5p 表達，進而導致survivin 的表達升高。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員，在包括鱗癌在內的大多數惡性腫瘤中均過表達，這與不良預后、侵襲性腫瘤行為、耐藥和高腫瘤復發率相關。Survivin能拮抗凋亡，促進腫瘤相關血管生成，并對各種抗癌療法起到抵抗因子的作用，是腫瘤發病和復發的診斷生物標記物，也是癌癥藥物的有效靶點。因此，miR-195-5p 表達降低導致的survivin 表達升高可能是食管鱗癌放射抵抗的原因之一。

本研究在細胞水平證實了在食管鱗癌細胞中放射線照射可以通過抑制miR-195-5p 增強survivin 的表達，過表達miR-195-5p 可以通過靶向抑制survivin，降低細胞存活率，誘導細胞凋亡，從而增強食管鱗癌細胞的放射敏感性，這首次證明了miR-195-5p 在食管鱗癌放射治療中的作用，并為miRNAs 在放射抵抗中的臨床應用提供了理論基礎，也為進一步研究miR-195-5p 在食管鱗癌放射敏感性中的作用奠定了基礎。在接下來的工作中可以繼續深入研究miR-195-5p 與食管鱗癌放射治療的相互作用及機制，通過局部注射給藥方式，使用miRNA 激動劑(agomir)在動物體內模擬高表達miRNA，進一步探索miR-195-5p作為預測食管鱗癌患者放療應答和預后的潛在標志的可能，通過靶向干預miR-195-5p 的表達降低食管鱗癌患者的輻射抵抗，為食管鱗癌患者的靶向治療提供新的思路。