食管鱗癌中SERPINB5表達降低的作用機制及其臨床意義

張 娜，范志露，楊荔艷，常 晨，蔡 巖，郝佳潔，王明榮

(國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院，分子腫瘤學國家重點實驗室，北京 100021)

食管鱗癌是我國乃至世界上最常見的癌癥死亡原因之一。由于對該疾病的認識尚不充分，食管鱗癌(尤其是中晚期食管鱗癌)的治療效果欠佳，患者總體生存期相對較短。因此，探索食管鱗癌發生發展的分子機制至關重要。

絲氨酸肽酶抑制劑分支B 成員5(serpin peptidase inhibitor clade B member 5，SERPINB5)，也稱為乳腺癌絲氨酸蛋白酶抑制子Maspin，但其實際并無絲氨酸蛋白酶抑制活性，其在不同的細胞中可能發揮不同的作用。SERPINB5已被報道與腫瘤相關，但其在不同腫瘤中的變化也不一致。例如在乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、胃癌、膠質瘤和口腔癌中，SERPINB5表達下調。相反，在甲狀腺癌、膽囊癌、結直腸癌以及胰腺癌中，SERPINB5 表達上調。有研究表明，食管鱗癌組織中SERPINB5 mRNA表達水平下調，但是尚不清楚其在該病中的作用。

本研究發現，食管鱗癌組織中SERPINB5 的mRNA 和蛋白質水平均較正常食管組織降低。過表達SERPINB5 可抑制AKT/mTOR 通路，進而降低食管鱗癌細胞的增殖、集落形成以及裸鼠成瘤能力。本研究進一步鑒定了與高表達SERPINB5 協同抑制食管鱗癌細胞生長的小分子抑制劑，探討了SERPINB5 對食管癌治療可能的意義。

1 材料與方法

1.1 公共數據庫分析

從基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov)下載81 例食管鱗癌組織的SERPINB5 mRNA 表達數據和臨床病理參數信息，并從中提取SERPINB5 mRNA 每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段(fragments per kilobase per million，FPKM)值與T 分期、淋巴結轉移、組織學分級、疾病分期和生存時間信息并進行相關性分析。從基因表達庫(Gene Expression Omnibus，GEO)數據庫下載GSE20347微陣列數據集，比較SERPINB5 mRNA在正常組織和腫瘤組織中的表達情況。

1.2 食管癌臨床樣本

16例食管鱗癌組織及配對的手術切緣正常組織均來自中國林州食管癌醫院。患者手術前未接受過任何治療，所有標本均為病理診斷后的剩余標本。本研究已獲得中國醫學科學院腫瘤醫院倫理委員會的批準(No.16-084/1163)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

食管鱗癌細胞系KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE150、KYSE180、KYSE450和KYSE510 細胞為日本東京大學Shimada 教授惠贈，TE1 和TE10 購自美國組織細胞培養庫(American Tissue Culture Collection，ATCC)公司，均使用含10%胎牛血清(澳大利亞 Ausgene X 公司)的 RPMI 1640 培養基(中國細工生物公司)，置于37 ℃、CO體積分數為5%的培養箱中培養。人胚腎細胞293FT(美國Invitrogen 公司)使用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養基(中國細工生物公司)，添加1%非必需氨基酸、1% L 型谷氨酰胺以及1% Geneticin(美國Gibco 公司，10131-035)，置于37 ℃、CO體積分數為5%的培養箱中培養。

1.3.2 過表達載體構建

從KYSE150 細胞中提取RNA，使用逆轉錄試劑盒(康為世紀公司)獲得cDNA，以該cDNA 為模板進行PCR 獲得SERPINB5 的編碼區全長。分別使用真核表達載體pcDNA3.1(+)/Myc-His C和慢病毒表達載體pLVX-IRES-Neo構建用于瞬時過表達和穩定過表達SERPINB5 的載體。用于構建瞬時過表達載體的引物序列：上游，5′-CCCAAGCTTATG GATGCCCTGCAACTA-3′；下游，5′-CCGGAATTCC AGGAGAACAGAATTTGCCAA-3′；用于構建穩定過表達載體的引物序列：上游，5′-CCGGAATTCATGGAT GCCCTGCAACTAG-3′；下游，5′-GCTCTAGAAGGA GAACAGAATTTGCCAAAGA-3′。

1.3.3 細胞轉染實驗

取對數生長期的細胞以30%～50%的密度接種于6孔板中，37 ℃培養12 h后進行轉染，設置親本組、pcDNA3.1 空載組和SERPINB5 過表達組。首先將原培養液棄掉，PBS 清洗兩遍后加入1 mL 無血清培養基備用。然后分別配制A 液[5 μL lipofectamine 2000(美國Thermo Fisher Scientific公司)+250 μL Opti-MEM(美國 Gibco 公司)]和 B 液[2.5 μg 質粒DNA+250 μL Opti-MEM]，室溫孵育5 min，將二者混勻并室溫孵育20 min，加入培養皿中。37 ℃培養6 h后更換為完全培養基，繼續培養48 h后收集細胞進行后續實驗。

1.3.4 慢病毒包裝和細胞感染

慢病毒包裝質粒psPAX2 和pMD2G 均為本實驗室保存質粒載體。取對數生長期的293FT細胞以80%的密度接種于6 cm平皿中，37 ℃培養12 h 后進行轉染。首先將原培養液棄掉，PBS清洗兩遍后加入2 mL無血清培養基備用。然后分別配制 A 液(18 μL lipofectamine 2000+500 μL Opti-MEM)和 B 液(6 μg 質粒 DNA+3 μg psPAX2+3 μg pMD2G+500 μL Opti-MEM)，室溫孵育5 min，將二者混勻并室溫孵育20 min，加入培養皿中，6 h 后更換為2.5 mL 含30%胎牛血清的完全培養基培養，24 h和48 h后各收集一次病毒上清，用0.45 μm濾膜過濾，保存于-80 ℃冰箱。感染靶細胞時，設置親本組(不加病毒上清)和pLVX空載組(加pLVX空載病毒上清) 為 對 照 組 ， SERPINB5 過 表 達 組 ( 加 pLVXSERPINB5病毒上清)為實驗組，將0.5 mL病毒上清和1.5 mL 完全培養基加入6 孔板中密度為50%左右的靶細胞中，加入濃度為8 μg/mL的Polybrene(上海翊圣生物科技有限公司)，感染12 h 后更換為完全培養基，利用 500 μg/mL 的 Geneticin 篩選 7 d 后，更換為 250 μg/mL的Geneticin培養。

1.3.5 蛋白提取和Western blot實驗

培養細胞至對數生長期時收獲(對于轉染后的細胞，則于轉染48 h后收獲)，用預冷PBS 洗2 次，加入適量PBS，用細胞刮刮取細胞于收集管中，1 000 r/min 離心5 min，棄上清獲得細胞沉淀。加入適量蛋白裂解液(碧云天公司，P0013B)，冰上裂解30 min，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清移至新的離心管中。臨床標本蛋白采用組織蛋白提取試劑盒提取(美國Invent Biotechnologies 公司)。使用BCA 蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific 公司)進行蛋白定量。取一定體積的蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，98 ℃金屬浴中變性10 min，瞬時離心。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳90 min，使用濕轉電轉儀將蛋白從分離膠轉移至PVDF 膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗后4 ℃孵育過夜。一抗包括：購自美國Cell Signaling Technology 公司的p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR 抗體 ， 購 自 美 國 Proteintech 公 司 的 SERPIN B5、GAPDH、His 標簽(66005-1-Ig)抗體，購自美國Immunoway 公司的Aurora A 抗體，以及購自美國Abcam 公司的 p-Aurora A 抗體。使用 TBST 清洗 4 次，每次6 min，加入相應二抗，室溫孵育1 h，TBST 清洗4 次，每次6 min，使用LAS4010 或Amersham Imager 800 成像儀進行曝光。使用ImageJ 軟件分析灰度值并計算蛋白相對表達量。

1.3.6 細胞增殖和克隆形成實驗

收集細胞并進行計數，取1 000 個細胞接種于96 孔板中，每組(親本組、空載組和SERPINB5 過表達組)設置4 個平行孔和空白對照孔，于37 ℃、CO體積分數為5%培養箱中培養12 h 后開始，每天同一時間取出一塊96 孔板進行檢測。每孔加入100 μL CCK-8稀釋液(購自日本同仁化學，使用RPMI 1640 按1∶10 比例稀釋)，于37 ℃培養箱中培養1 h。使用酶標儀(美國BioTek 公司)在450 nm處測量吸光度值，計算相對生長速率，繪制細胞生長曲線。

將對數生長期的細胞用胰酶(美國Gibco公司)消化計數，6 孔板每孔接種1 000 個細胞，于37 ℃培養箱培養14 d。待集落肉眼可見時，甲醇固定30 min，棄去固定液，稍干燥后加入0.5%結晶紫染色10 min，蒸餾水洗去殘余染液，拍照獲得集落形成圖。

1.3.7 裸鼠移植瘤實驗

SPF級4周齡雌性BALB/cA-nu 裸鼠(北京華阜康生物科技股份有限公司)，實驗前稱體質量，按照體質量分組，設置pLVX 空載組和SERPINB5 過表達組，使不同體質量的裸鼠在各組間平均分布。將生長狀態良好的對數生長期細胞消化，PBS清洗兩遍，重懸于PBS中，計數。將濃度為1×10個/mL 的細胞接種于裸鼠上肢腋下部位。待瘤體長出后每周測量2 次皮下瘤體積。計算公式為：體積=長徑×短徑×短徑×0.5。3 周后處死裸鼠，解剖并稱取瘤體質量。

1.3.8 靶向抑制實驗

在96 孔板中以5 000 個細胞/孔的密度接入穩定過表達SERPINB5 和空載體的KYSE150細胞，12 h后棄掉培養液，每孔加入90 μL新鮮培養基，再加入10 μL 已配制成10 μmol/L 的小分子抑制劑庫(美國Selleck 公司，終濃度為1 μmol/L，含0.1% DMSO)，對照組加10 μL 生理鹽水(含0.1%DMSO)，于37 ℃、CO體積分數為5%的培養箱培養72 h，每孔加入100 μL CCK-8稀釋液，于37 ℃培養箱中培養1 h，測量450 nm處的吸光度值。將每孔吸光度值減去本底吸光度值用于后續計算，公式如下：

用以下公式計算過表達SERPINB5 與小分子藥物聯合的協同效率：

其中，

E

a為過表達SERPINB5的抑制率，

E

b為小分子抑制劑藥物的抑制率，

E

ab為過表達SERPINB5和小分子抑制劑藥物的聯合抑制率，當偏差值≥1.15時，表示過表達SERPINB5 與小分子藥物作用具有協同抑制效應。平板抑制實驗每孔接種2×10個細胞，12 h后以1 μmol/L濃度的藥物(與SERPINB5過表達具有協同效應且抑制率在前20 名的小分子抑制劑)處理5 d，對照組用1 μmol/L濃度的DMSO處理5 d，棄去藥物，甲醇固定30 min，棄去固定液，稍干燥后加入0.5%結晶紫染色10 min，用蒸餾水洗去殘余染液，拍照獲得圖像。

1.4 統計學分析

使用SPSS statistics 23.0和GraphPad Prism 8.0對實驗數據進行統計學分析和可視化，

t

檢驗和非參數檢驗比較組間的差異。

P

＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 食管鱗癌中SERPINB5 表達變化及其與臨床病理指標之間的相關性

食管鱗癌TCGA RNA 測序數據顯示，SERPINB5 mRNA表達水平與組織學分級(

P

=0.004)和疾病分期(

P

=0.037)顯著相關，且SERPINB5水平較高的患者生存期較長，但差異無統計學意義(圖1A)。GEO 數據集分析結果表明，與正常組織相比，SERPINB5 mRNA 在腫瘤組織中的表達明顯降低(

n

=17，

P

=0.001；圖1B)。本研究進一步利用16例配對的正常上皮組織及食管鱗癌組織進行了Western blot 檢測，結果顯示13 例食管癌組織中的SERPINB5蛋白水平顯著降低(

P

=0.000 4，圖1C)。

2.2 過表達SERPINB5 抑制食管鱗癌細胞的增殖和裸鼠成瘤

本研究首先檢測了SERPINB5 在食管鱗癌細胞系中的表達情況。結果表明，SERPINB5 在KYSE30、KYSE140、KYSE180、KYSE450和TE10中高表達，在KYSE70、KYSE150、KYSE510和TE1中表達水平較低(圖2A)。選取KYSE150 和TE1 細胞系瞬時過表達SERPINB5。結果顯示，與對照組相比，過表達組His-SERPINB5 水平顯著升高，差異具有統計學意義(

P

＜0.05，圖2B)，且過表達SERPINB5顯著抑制食管鱗癌細胞的增殖和克隆形成(圖2C 和2D)，與pcDNA3.1空載組相比，差異具有統計學意義(

P

＜0.01)。本研究還構建了穩定過表達SERPINB5 的KYSE150 和TE1 細胞，集落形成實驗獲得了與瞬時過表達一致的結論(圖2E和2F)。裸鼠移植瘤實驗表明，過表達SERPINB5顯著抑制了KYSE150 細胞的成瘤能力(圖2G)，與pLVX空載組相比，差異具有統計學意義(

P

＜0.01)。

2.3 SERPINB5 通過失活AKT/mTOR 通路抑制食管鱗癌細胞增殖

為了進一步探究SERPINB5 在食管鱗癌細胞中的作用機制，本研究檢測了常見的與增殖相關的分子變化。結果顯示，與親本和pcDNA3.1 空載組相比，過表達SERPINB5 后，蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的磷酸化水平顯著降低，表明SERPINB5 可能通過抑制AKT/mTOR 通路抑制食管鱗癌細胞的增殖(圖3)。

2.4 過表達SERPINB5 顯著增強食管鱗癌細胞對Aurora A和mTOR抑制劑的敏感性

聯合用藥是一種能夠增強藥物對腫瘤細胞殺傷能力、提高藥物療效、克服耐藥的有效策略。前面的實驗結果表明，SERPINB5 作為抑癌基因起作用，因此在提高SERPINB5 表達水平的同時進行靶向藥物處理，可能獲得更加有效的聯合抑制效果。本研究利用小分子抑制劑處理穩定過表達SERPINB5 的KYSE150細胞，獲得了與SERPINB5 過表達具有協同抑制效應的小分子抑制劑(圖4A)。細胞生長和克隆形成抑制實驗表明，提高SERPINB5 表達可增強KYSE150 細胞對Everolimus(mTOR 抑制劑)和 Alisertib(Aurora A)抑制劑的敏感性(圖4B 和4C)。與 SERPINB5 單獨過表達組和單獨藥物處理組相比，差異具有統計學意義(

P

＜0.01)。本研究進一步檢測了上述藥物的靶點在SERPINB5 過表達細胞中的變化，結果顯示過表達SERPINB5 后，p-mTOR 表達下調，而 p-Aurora A 表達上調(圖4D和4E)。

3 討 論

圖1 SERPINB5在食管鱗癌臨床樣本中的表達情況

SERPINB5 屬于絲氨酸蛋白酶抑制子家族成員之一，其由375 個氨基酸組成，相對分子質量為4.2×10，可定位于細胞質、細胞核、囊泡、細胞表面，以及細胞外基質中。研究表明，SERPINB5具有抑制腫瘤生長、侵襲和遷移的生物學功能。本研究發現SERPINB5 mRNA 和蛋白表達水平在食管鱗癌中均發生下調，且SERPINB5 表達與組織學分級和疾病分期顯著相關。本研究還發現，SERPINB5 表達較高的腫瘤患者可能具有更長的總生存期，但此結論需通過更大樣本的檢測進一步驗證。

目前，SERPINB5 相關的研究大多只是表達水平的檢測及與臨床病理指標相關性的分析，對其作用及其機制研究較少。總體上，SERPINB5 在乳腺癌中的研究相對較多，有報道SERPINB5 通過促進癌細胞凋亡、抑制侵襲和血管形成而抑制乳腺腫瘤的進展。研究發現SERPINB5 表達降低可加速細胞周期進程，與彌漫型胃癌易感性增加相關。在直腸癌中，SERPINB5 高表達與淋巴管浸潤、同步放化療不敏感和患者預后不良相關。另外，SERPINB5可抑制雄激素受體的活性，從而增強恩雜魯胺(enzalutamide)的抗腫瘤作用。在肺癌中，有文獻報道SERPINB5通過低甲基化發揮癌蛋白作用；但另有研究表明，肺癌中SERPINB5 的高表達與放射敏感性和化療敏感性相關，其表達降低可能通過維持AKT磷酸化促進化療耐藥。本研究首次發現，SERPINB5過表達可通過抑制AKT和mTOR的活化，從而抑制食管鱗癌細胞的增殖和裸鼠皮下成瘤，在食管鱗癌中作為抑癌基因發揮作用。

圖2 過表達SERPINB5抑制食管鱗癌細胞增殖和裸鼠成瘤

圖3 過表達SERPINB5后Western blot檢測AKT/mTOR通路蛋白的表達情況

圖4 過表達SERPINB5顯著增強食管鱗癌細胞對Aurora A和mTOR抑制劑的敏感性

腫瘤的發生發展是一個多因素、多階段的發展過程，其中有大量癌基因的激活和抑癌基因的失活。因此，單一藥物只能針對個別靶點或通路發揮作用，很難有效抑制腫瘤的生長與進展，且容易產生耐藥性。目前，聯合用藥已被廣泛地應用于腫瘤的治療，用于取得協同療效，降低藥物劑量和毒性，并盡量減少或延遲繼發耐藥。本研究發現一些與SERPINB5 過表達具有協同抑制效果的小分子抑制劑，其中Alisertib(Aurora A 抑制劑)和 Everolimus(mTOR 抑制劑)較為有效。另外，本研究發現上述兩種抑制劑對被測細胞的有效性取決于不同的分子基礎。Everolimus 在mTOR磷酸化水平較高的食管鱗癌細胞中有效，其與SERPINB5 通過靶向相同的mTOR 信號通路協同作用，從而抑制食管鱗癌細胞的增殖和存活。本研究的結果還提示，SERPINB5 低表達的腫瘤細胞可能具有更高的mTOR 磷酸化水平，并且可能對Everolimus 更加 敏 感 。 與 Everolimus 不 同 的 是 ， Alisertib 與SERPINB5 過表達的聯合抑制效果與Aurora A 的激活有關，這表明SERPINB5過表達可以通過激活Alisertib靶蛋白而增強低表達SERPINB5 的食管鱗癌細胞對Alisertib的敏感性。

總之，本研究發現SERPINB5 通過抑制AKT 和mTOR的活性而發揮抑癌作用；SERPINB5蛋白在食管鱗癌中表達顯著下調，可能作為食管鱗癌輔助診斷的重要指標；提高SERPINB5 的表達水平，尤其是與Aurora A 或mTOR 抑制劑的聯合使用，可望為食管鱗癌提供有效的治療策略。