基于TRPV4通路探討針刀對兔膝骨關節炎軟骨細胞凋亡的影響

曾維銓，劉 晶，連曉文，林巧璇，盧莉銘，郭澤興，楊金碩，陸潤銘，修忠標，4*

（1.福建中醫藥大學附屬康復醫院，福建 福州350003；2.福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建 福州350004；3.福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州350122；4.中醫骨傷及運動康復教育部重點實驗室，福建 福州350122）

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是臨床常見骨關節病，有效延緩軟骨退變進程是臨床防治KOA亟待解決的 難題［1］，調節骨骼肌功能、恢復膝關節筋骨平衡是防治KOA有效策略［2］。針刀療法擅長松解慢性損傷肌肉、韌帶粘連、瘢痕和疏通堵塞，具有良好力學調節作用［3-4］，可有效緩解KOA關節疼痛和改善關節功能［5］，然而針刀治療KOA的力學調節機制尚不明確。研究表明膝關節筋骨失衡導致的異常軟骨應力能活化香草素受體亞家族4（transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4）通路，促進軟骨細胞凋亡［6］。因此，本研究通過改良Videman法建立KOA兔模型，從TRPV4通路介導軟骨細胞凋亡的角度入手，探討針刀治療KOA可能的作用及機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康雄性6月齡新西蘭大白兔24只，體質量（2.0±0.5）kg，訂購于上海松聯實驗動物責任有限公司，生產許可證號：SCXK（滬）2017-0008，委托福建省中醫藥研究院實驗動物中心代購并飼養，合格證號：SYXK（閩）2016-0005。實驗動物單籠喂養，飼養房溫度20～25℃，濕度30%～60%，自然光照，自由進食、飲水。本實驗已通過福建省中醫藥研究院動物實驗倫理委員會批準（批件號：FJATCMIAEC2019037），整個實驗過程中對動物的各種處理均遵照中華人民共和國科技部2006年頒布的有關動物的使用及倫理學規定。

1.2 實驗試劑HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；TRPV4抗體（美國abcam公司）；Caspase-3抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；二抗（武漢三鷹生物技術有限公司）；RN54-EASYspin Plus骨組織RNA快速提取試劑盒（北京愛德萊生物科技有限公司）；mRNA逆轉錄試劑盒（中國北京康為世紀有限公司）；戊巴比妥鈉、10%EDTA（上海國藥集團化學試劑有限公司）；4%多聚甲醛、10% EDTA、0.9% NaCl注射液（南京丁貝生物有限公司）。

1.3 實驗儀器 一次性使用0.4 mm×40 mm無菌小針刀（江西老宗醫醫療器械有限公司）；光學顯微鏡、自動脫水機、組織包埋機、Leica 2025石蠟切片（德國Leica公司）；高分子石膏（陜西安信醫學技術開發有限公司）；普通石膏（浦江健宇衛生材料有限公司）；手術刀片及相關器械（上海醫療器械批發有限公司）；一次性包埋盒、包埋模具（上海源葉生物技術有限公司）；粘附載玻片、蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 新西蘭大白兔適應性飼養1周后，按照體質量進行編號，采用隨機數字表法分為空白組、模型組、針刀組，每組各8只。參照本團隊前期研究的改良Videman法［7］，將兔子仰臥于固定架上，膝前放置石膏托，高分子石膏繃帶單層螺旋纏繞，保持膝關節伸直中立位0°，踝關節背曲60°，最后使用防啃咬繃帶環形纏繞高分子石膏表面。造模6周后，膝關節Lequesne MG行為學評分增高，X線和MRI影像學檢測示關節間隙變窄、軟骨面欠光滑，則造模成功。

2.2 干預 造模成功1周后，針刀組依據《中國經筋學》［8］膝關節經筋病灶點命名及定位，根據兔的骨度分寸，選取治療點“鶴頂次”“髕外上”“髕內上”“髕外下”“髕內下”“陰陵上”。施術部位消毒，鋪無菌洞巾，采用一次性0.4 mm×40 mm無菌小針刀進行松解，刀口線垂直皮膚進針刀，針刀抵達病變處行提插刀法松解，范圍不超過0.5 cm。見圖1。每7 d干預1次，共干預4次。空白組、模型組常規飼養，未做其他特殊處理。

圖1 針刀組針刀治療示意圖

2.3 取材 于針刀干預結束后1周，經腹腔麻醉后耳緣靜脈空氣栓塞處死，迅速解剖左側膝關節，取出兔左側膝關節股骨髁軟骨組織。

2.4 HE染色光鏡觀察及Mankin’s評分 兔左側膝關節股骨髁軟骨組織粗修后于4%多聚甲醛中固定24 h，10% EDTA脫鈣完全后修切，常規石蠟包埋后5μm切片。常規脫蠟后，浸入蘇木精液中染色20 min，10%鹽酸乙醇分色3 s，PBS返藍20 min，入伊紅染料復染30 s，染色完成后用中性樹膠封片。光鏡下對軟骨組織結構進行觀察及圖像采集，按照軟骨部位選取1 024×768像素大小的圖像，每張載玻片選擇3個視野，參照Mankin’s評分［9］進行分數統計，取其平均值。分級標準：正常0～2分，輕度病變3～7分，中度病變8～11分，重度病變12～14分。2.5 Tunel染色 石蠟組織切片經脫蠟水化處理后，PBS漂洗5 min×2次；滴加蛋白酶K工作液，37℃反應30 min，PBS漂洗5 min×2次；浸入封閉液（1 mL 30%H2O2溶于9 mL甲醇）中室溫封閉10 min，PBS漂洗5 min×2次；滴加TdT酶反應液，加蓋玻片37℃避光濕潤反應60 min，PBS漂洗5 min×3次；滴加Streptavidin-HRP工作液，加蓋玻片37℃濕潤避光反應30 min，PBS漂洗5 min×3次；DAB顯色，雙蒸水充分漂洗終止反應；蘇木素復染，逐級乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。通過光學顯微鏡觀察，細胞核呈棕黃色為陽性著色。采用HPIAS 21000圖像分析系統進行分析處理，選擇細胞分布較均勻的高倍視野計數，根據公式計算細胞凋亡指數。

2.6 RT-PCR檢測軟骨組織TRPV4、Caspase-3 mRNA表達 取兔膝關節軟骨置于研缽中，加入液氮快速研磨，使用骨組織RNA提取試劑盒提取總RNA，核酸紫外分光光度計測定RNA純度和濃度。采用MMLV-PCR擴增試劑盒反轉錄二步法，cDNA置于-20℃保存備用。PCR反應體系中含標本體系3μL，引物體系17μL，總體系20μL。引物由上海生物工程股份有限公司設計，GAPDH正向：TGGAATCCA CTGGCGTCTTCAC，反 向：AGGATGCGTTGCTGACA ATCTTGA；TRPV4正 向：AAGTTTGGAGCGGTCTCG TT，反向：GGTAAGGGTATGGCGGAGTG；Caspase-3正向：AGCAAATCAATGGACTCTGGGAA，反向：CCC GAGGTTTGCTGCATTTAC。PCR反 應 條 件：95℃10 min，95℃15 s，72℃30 s，共40個循環，采用相對定量2-ΔΔCt法分析結果。

2.7 Western blot檢測軟骨組織TRPV4、Caspase-3蛋白表達 組織裂解法提取兔軟骨組織總蛋白，BCA法測定蛋白含量后，SDS-PAGE凝膠電泳，NC膜轉印，一抗、二抗孵育，ECL顯色曝光。Gel Doc 2000凝膠成像系統成像，Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH作為內參照蛋白進行校準，采用目標蛋白條帶灰度值／GAPDH條帶灰度值來表示目的蛋白相對表達水平。

2.8 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料服從正態分布采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。不服從正態分布采用中位數（四分位數間距）［M（IQR）］表示，采用秩和檢驗進行比較。

3 結 果

3.1 3組兔實驗情況 實驗期間各組兔精神狀態良好，體質量、進食量基本一致，實驗過程中動物無死亡。

3.2 3組兔軟骨組織HE染色形態學觀察 空白組軟骨表面光滑，層次結構清晰，細胞排列規整，潮線清晰完整；模型組軟骨表面不光滑，部分缺損，細胞分布不均勻，潮線紊亂；針刀組軟骨表面較光滑，層次結構較清楚，細胞排列趨于整齊，潮線較模型組完整。見圖2。

3.3 3組兔軟骨組織Mankin’s評分比較 見表1。

圖2 3組兔軟骨組織HE染色圖（×100）

表1 3組兔軟骨組織Mankin’s評分比較［M（IQR）］

3.4 3組兔軟骨組織Tunel染色觀察 空白組可見少量散在的軟骨細胞凋亡；模型組可見大量的軟骨細胞凋亡，呈片狀分布；針刀組軟骨細胞凋亡數明顯少于模型組，趨于空白組。見圖3。

圖3 3組兔軟骨TUNEL染色圖

表2 3組關節軟骨細胞凋亡率比較（±s）

表2 3組關節軟骨細胞凋亡率比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

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3.5 3組兔軟骨細胞凋亡率比較 見表2。

3.6 3組兔軟骨組 織TRPV4、Caspase-3 mRNA表達比較 見表3。

表3 3組兔軟骨組織TRPV4、Caspase-3 mRNA表達比較（±s）

表3 3組兔軟骨組織TRPV4、Caspase-3 mRNA表達比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

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3.7 3組兔軟骨組織TRPV4、Caspase-3蛋白表達比較 見圖4、表4。

圖4 3組兔軟骨組織TRPV4、Caspase-3蛋白電泳圖

表4 3組兔軟骨組織TRPV4、Caspase-3蛋白表達比較（±s）

表4 3組兔軟骨組織TRPV4、Caspase-3蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

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4 討 論

KOA是生物學因素和力學因素共同作用下以關節軟骨退變為主，最終導致軟骨結構破壞、滑膜增厚、骨質增生及關節內炎癥反應，嚴重影響患者的生活質量［10］。中醫學經筋理論從氣血和力學角度闡明KOA核心病機為“氣血失和，筋骨失衡”，關鍵治則為“解結橫絡、調和氣血、調衡筋骨”［11］。針刀具有“針刺”和“刀割”雙重功效，擅長對病損軟組織粘連、瘢痕、攣縮進行松解和疏通堵塞，主要功效為改善骨骼肌、韌帶功能，調節力學平衡［12］。因此，基于經筋理論針刀循膝周經筋病灶點松解是治療KOA有效途徑［13］。研究表明，“鶴頂次”“髕外上”“髕內上”“髕外下”“髕內下”和“陰陵上”為KOA高頻經筋病灶點和治療點［14-15］，基于此，本團隊選取上述病灶點行針刀松解，以達到調節膝關節“氣血和暢、筋骨平衡”目的，從而有效緩解KOA疼痛和功能障礙，延緩軟骨退變。

研究結果顯示，與空白組比較，模型組軟骨表面不光滑，部分缺損，層次結構不清，細胞分布不均勻，可見細胞簇集，潮線紊亂，Mankin’s評分明顯升高。經過針刀干預后，軟骨形態及Mankin’s評分均明顯改善，表明基于經筋理論針刀松解能夠有效延緩KOA兔軟骨退變。

KOA主要表現為軟骨細胞凋亡顯著增多，其增殖、凋亡動態平衡被打破，關節軟骨細胞大量減少，最終導致關節軟骨退變［16］。本研究運用Tunel染色檢測軟骨細胞凋亡情況，結果表明模型組軟骨細胞凋亡率顯著高于空白組，而針刀組軟骨細胞凋亡率比模型組明顯降低，這提示基于經筋理論針刀松解能夠減少KOA兔軟骨細胞凋亡，延緩軟骨退變。

TRPV4是一種機械敏感離子通道，在軟骨、骨和滑膜等多種肌肉骨骼組織中廣泛表達，介導軟骨細胞對機械應力的反應［17］。膝關節筋骨失衡過度機械應力可活化TRPV4，引起Ca2＋大量內流，激活細胞內凋亡分子Caspase-3表達，促進軟骨細胞凋亡，加劇軟骨細胞退變。本研究運用RT-PCR和Western blot檢測軟骨TRPV4、Caspase-3分子表達，結果表明模型組軟骨TRPV4、Caspase-3 mRNA和蛋白的表達較空白組顯著增高，而針刀組軟骨TRPV4、Caspase-3 mRNA和蛋白的表達較模型組顯著降低。可見，基于經筋理論針刀松解能夠抑制TRPV4信號通路，使TRPV4降低表達，進而下調下游靶點促凋亡蛋白Caspase-3表達，從而有效減少軟骨細胞凋亡，延緩軟骨退變。

綜上所述，基于經筋理論運用針刀循膝周常見經筋病灶點松解，能有效減少KOA兔軟骨細胞凋亡，延緩軟骨退變，其作用機制可能與抑制TRPV4通路，下調TRPV4、Caspase-3表達有關。