白藜蘆醇對銀屑病HaCaT細胞增殖、凋亡及STAT3信號通路的影響

張 敏，彭 嬌，劉 潔，毛倩倩，陳麗明，林明和*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州350122；2.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建 福州350003）

銀屑病是一種臨床常見的皮膚病，以皮膚出現形狀不一、大小不等的紅斑和肥厚的白色鱗屑為主要特征，以淋巴細胞浸潤、角質細胞異常增生、細胞因子分泌異常為主要病理表現［1-2］。該病病程長，易反復發作，可不同程度影響患者生活質量［3-4］。西醫治療銀屑病多采用糖皮質激素、免疫抑制劑及維甲酸類等藥物治療，可在短期內改善臨床癥狀，但緩解期過短，停藥后復發風險極高，且長期應用可出現明顯不良反應［5］。白藜蘆醇（resveratrol，RES）是廣泛存在于植物中的一類活性成分，具有抗腫瘤、抗突變、抗炎及免疫調節等作用［6］。相關研究表明，RES具有抑制HaCaT細胞增殖及誘導凋亡的作用［7］，其作用機制可能與信號傳導及轉錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路有關，STAT3通路高度參與銀屑病角質細胞的異常增殖、活化及凋亡全過程［8］。本研究以體外培養HaCaT細胞為研究對象，研究RES抑制HaCaT細胞增殖及促進凋亡的作用及其對STAT3信號通路的調控作用，為中藥治療銀屑病的臨床應用提供新的思路。

1 實驗材料

1.1 細胞及藥物來源 人永生化表皮細胞HaCaT（貨號：KG300）購自南京凱基生物技術有限公司，于福建中醫藥大學醫學實驗中心液氮中保存；RES用DMSO配制成濃度為50 mmol／L的溶液，超聲10 min助溶，于-20℃貯存備用。

1.2 實驗試劑DMEM、FBS、胰酶（美國Life Technologies公司）；青霉素-鏈霉素混合液（Penicillin-Streptomycin）、細胞裂解液（Pierce RIPA Buffer）、BCA蛋白定量分析試劑盒（美國Thermo公司）；MTT粉末（北京索萊寶科技有限公司）；DMSO（廣州濟恒醫藥科技有限公司）；細胞周期即時檢測試劑盒、AnnexinⅤ-FITC／PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物技術有限公司）；磷酸酶抑制劑（Phos-STOP EASYpack，美國Roche公司）；蛋白酶抑制 劑（CALBLOCHEM公司）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（康為世紀公司）；STAT3、p-STAT3、Pim-1原癌基因絲氨酸／蘇氨酸激酶（Pim-1 proto-oncogene，serine／threonine kinase，PIM1）、B淋巴細胞瘤-2（Bcell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl2-Associated X的 蛋白質（Bcl2-associated X，Bax）抗體［生工生物工程（上海）股份有限公司］；Cyclin D1、β-actin抗體及二抗（羊抗兔IgG）（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.3 實驗儀器CO2培養箱（美國Thermo公司）；倒置顯微鏡系統（徠卡儀器公司）；細胞計數儀（美國Countstar公司）；Elx800酶標儀（美國BioTek公司）；流式細胞儀（FCM）（美國BD公司）；7500 realtime PCR儀（美 國ABI公 司）；APC 300電 泳 儀、ChemiDocXRS＋化學發光成像系統（美國BIO-RAD公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養及分組HaCaT細胞培養于RPMI 1640完全培養基中，并于37℃、5% CO2的培養箱中培養。細胞單層貼壁生長，待長至80%～90%匯合度時，根據實驗目的分別稀釋成不同細胞密度用于細胞傳代和后續實驗。根據實驗條件將細胞分為對照組和不同濃度（25、50、100μmol／L）的RES組，共4組，進行后續實驗。

2.2 倒置顯微鏡觀察細胞形態 取對數生長期的HaCaT細胞以2.5×105個／孔濃度接種于6孔板，待每孔細胞匯合度達到50%～60%時，加入等體積不同濃度的RES（25、50、100μmol／L）干預24 h，在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態變化并拍照。

2.3 MTT法檢測細胞活力 取對數生長期的Ha-CaT細胞，用含EDTA-0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，進行細胞計數后用DMEM完全培養基調整細胞密度為1×105個／mL，種于96孔培養板，100μL／孔，置37℃含5% CO2培養箱培養，至細胞貼壁生長覆蓋率達50%時，加入不同濃度的RES（0、25、50、100μmol／L）刺激，分別干預24 h和48 h后吸取各孔溶液，每孔加入100μL的0.5 mg／mL MTT溶液，37℃培養4 h后，小心吸去孔內液體。往每孔內加入100μL DMSO，振蕩后，在570 nm處測A值。

2.4 AnnexinⅤ／PI雙染法檢測細胞凋亡 取對數生長的HaCaT細胞以2.5×105個／孔濃度接種于6孔板后，置37℃細胞培養箱中培養過夜，經不同濃度RES干預24 h，收集細胞，離心，重懸和計數后，收集5×105細胞，依次加入500μL Binding Buffer、5μL AnnexinⅤ-FITC和5μL碘 化 丙 啶（propidium iodide，PI）后，混勻，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀用488 nm激發光、530 nm發射光分析細胞凋亡情況。

2.5 Western blot法檢測相關蛋白表達 取不同濃度的RES干預HaCaT細胞24 h，提取蛋白后定量；SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉法將蛋白質轉移至NC膜；5%牛奶封閉2 h后，置于PIM1、Bax、STAT3、p-STAT3、Cyclin D1、Bcl-2及β-actin一抗中4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次5 min，HRP標記的二抗37℃孵育1 h；TBST洗膜3次，ECL發光，曝光后掃描，采用BIO-RAD Chemi Doc XRS＋成像，以β-actin作為內參，對其他指標進行分析。

2.6 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。定量資料服從正態分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析；不服從正態分布者以中位數，四分位數間距進行統計描述，采用秩和檢驗。

3 結 果

3.1 RES對HaCaT細胞形態的影響HaCaT細胞經不同濃度的RES干預24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態的變化，圖中顯示隨著RES藥物濃度的增加，HaCaT細胞密度逐漸減少，漂浮細胞增多，說明RES對HaCaT細胞生長有顯著的抑制作用，并隨濃度的增加而增強，見圖1。3.2 RES對HaCaT細胞活力的影響 低濃度RES對HaCaT細胞活力無明顯影響，而高濃度RES隨濃度增加細胞活力明顯降低，同時呈現一定的劑量依賴和時間依賴（P＜0.05），表明RES干預能夠抑制HaCaT細胞生長。見圖2。

圖1 不同濃度RES干預HaCaT細胞形態圖（×200）

圖2 RES對HaCaT細胞活力的影響

3.3 RES對HaCaT細胞凋亡的影響 結果顯示，隨著藥物濃度的增加，凋亡細胞所占的比例逐漸上升，提示RES可促進HaCaT細胞的凋亡，見圖3。

3.4 RES對相關蛋白表達的影響Western blot檢測結果表明，不同濃度的RES可不同程度地增加Bax／Bcl-2的表達（P＜0.01），同時隨著藥物濃度的增 加，p-STAT3／STAT3、PIM1、Cyclin D1的 表 達 量逐漸降低（P＜0.01）。提示RES可抑制STAT3通路活化，抑制HaCaT細胞的增殖，促進凋亡。見圖4和圖5。

圖3 RES對HaCaT細胞凋亡的影響

圖4 RES對相關蛋白表達的影響

圖5 RES對相關蛋白表達的影響

4 討 論

銀屑病是一種與自身免疫相關的復發性慢性炎癥性皮膚病，主要病理表現為界限清楚、大小不一的紅色斑塊，上面附有銀白色的肥厚鱗屑，其發病機制與角質細胞異常增殖、分化及凋亡有關。一旦發生凋亡，磷脂酰絲氨酸（PS）會立刻從細胞膜脂質雙層的內側外翻到細胞膜脂質雙層的外側，這一變化早于細胞皺縮、染色質聚集濃縮、DNA片斷化、線粒體膜電位喪失及細胞膜的通透性增加等凋亡現象，是反應細胞發生凋亡的標志性現象，可作為細胞凋亡檢測的重要指標。其中，磷脂結合蛋白AnnexinⅤ與PS具有高度的親和力，被廣泛作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一，因此，本研究采用AnnexinⅤ／PI雙染 法檢 測RES對HaCaT細 胞凋亡的影響。前期已有研究證實Bcl-2的過度表達是導致皮膚病發生發展的一個主要原因，其作用機理是細胞對凋亡刺激的敏感性依賴于Bcl-2家族中抗凋亡和促凋亡成員之間的相互拮抗作用［9-10］；該家族中促凋亡成員Bad可通過蛋白間相互作用抑制Bcl-2的抗凋亡功能。PIM1激酶是PIM家族的一員，高度參與細胞周期及細胞增殖、凋亡，能直接磷酸化Bad，使之失去與Bcl-2的結合能力，從而解除Bad對Bcl-2的抑制作用，導致細胞周期動態 平 衡 失 調［11-12］。

STAT3信號通路在銀屑病的發生發展中起關鍵作用［13］。有研究表明，STAT3信號通路參與皮損表皮基層角質細胞的異常分化、血管異常增生、過度角化等多種病理過程，STAT3磷酸化的高度激活會導致異常的細胞增殖和惡性轉化，與銀屑病的發生發展密切相關［14］。因此STAT3信號通路在銀屑病的免疫反應和炎性反應及細胞信號傳遞中發揮重要作用［15-17］。而Cyclin D1是細胞周期G1／S期轉換的正向調節因子，是G1期細胞增殖信號的關鍵蛋白，Cyclin D1過度表達使細胞周期G1／S期轉換時間縮短，增加細胞周期轉換速度，導致細胞增殖［12］。Cyclin D1可以作為p-STAT3的靶基因參與細胞異常增殖進程［18］。RES是從中藥虎杖提取的主要活性成分，廣泛存在于多種植物中。據報道，RES的藥理學及生物學效應極其廣泛，具有抗炎抗氧化、抑瘤促凋亡、抗凝、抗突變及免疫調節等多種作用［19-21］。研究顯示，RES能夠具有抑制HaCaT細胞增殖及誘導凋亡的作用，在治療銀屑病方面前景廣闊，然而其具體機制還有待闡明。

本研究結果顯示，與對照組相比，RES實驗組在細胞增殖、凋亡方面比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；RES可提高凋亡相關基因Bax／Bcl-2的表達（P＜0.01）；同時RES可降低STAT3通路其他相關基因，如Cyclin D1、PIM1、p-STAT3／STAT3的表達，表明可通過抑制STAT3信號通路的活化來抑制HaCaT細胞增殖及促進其凋亡。結果表明STAT3信號通路參與了銀屑病的發生發展，且與HaCaT細胞的增殖和活化有關，經RES治療后，能夠抑制其增殖，促進其凋亡，提示RES是治療銀屑病的有效藥物。

綜上，本研究推測RES可能是通過調控STAT3信號通路，發揮抑制角質細胞增生、促進凋亡的作用，從而緩解皮膚過度角化，達到治療銀屑病的目的。本研究為臨床應用RES治療銀屑病提供了一定實驗依據，但目前對于RES對銀屑病的作用靶點尚不十分清楚，還有待于進一步研究。