呋塞米乳劑的制備及其在大鼠體內的藥代動力學研究

張 敏,劉惠娟,趙永睿,張世寧,楊亞楠

(1甘肅醫學院藥物分析與藥物化學教研室,平涼 744000;2甘肅醫學院藥劑教研室;3甘肅醫學院藥學系)

呋塞米又名速尿、呋喃苯胺酸,是高效能利尿藥,臨床廣泛用于充血性心力衰竭、肝硬化和腎疾病引起的水腫。目前市場上有片劑和注射劑兩種劑型,嬰幼兒患者在使用時多有不便,片劑服藥的順應性差,注射劑必須由專業醫護人員進行操作,疼痛刺激感較強。而乳劑能夠增強藥物滲透性,降低毒副作用,提高生物利用度,還可以通過矯味劑改善口感,改善用藥依從性[1,2]。

菜籽油俗稱菜油,是十字花科植物蕓苔(即油菜)的種子榨制所得的透明或半透明的液體,富含蛋白質、脂肪,具有軟化血管、延緩衰老的功效。課題組利用食用級菜籽油作為油相開發口服呋塞米乳劑,采用正交實驗篩選最優處方,對優化后的處方進行穩定常數、粒徑大小和乳滴合并速度的測試。并且分別對優化的處方乳劑和市面上的呋塞米片劑進行大鼠體內的藥物動力學考察,揭示乳劑的口服生物利用度,發現不同劑型的分布特點,為呋塞米劑型的開發和臨床應用提供參考。

1 材料

電子天平(德國sartorial公司,BP211D),臺式高速冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司,H-1650 R),超聲波清洗機(天津奧科賽恩斯儀器有限公司,AS系列),Agilent 1260高效液相色譜(美國Agilent公司,配置1260 DAD檢測器,Agilent Zorbax色譜柱),微孔針頭濾器,采血管。

呋塞米原料藥(武漢東康源科技有限公司,批號:20161015),尼泊金乙酯(天津市東麗區天大化工實驗廠20141008),菜籽油(產自青海省油菜籽冷榨而得),呋塞米對照品(北京中科盈創生物科技有限公司,編號:100544),呋塞米片(江蘇亞邦愛普森藥業有限公司批號:1711150,20 mg×100片),乙腈(色譜級,天津市光復精細化工研究所),乙醇、丙三醇、肝素鈉、羧甲基纖維素鈉、冰醋酸均為分析純。

SD大鼠,雄性,清潔級,體質量180-220 g,購于中國農業科學院蘭州獸醫研究所動物實驗中心,生產許可證:(甘)2017-030。

2 方法和結果

2.1 呋塞米乳劑制備的方法和處方優化

2.1.1 呋塞米乳劑的制備方法 精密稱取呋塞米約200 mg,與3 ml菜籽油均勻混合,加入乳化劑OP和甘油,研磨均勻后,加水適量,繼續用力沿一個方向研磨至出現“噼啪”聲,得到初乳,加入4%尼泊金乙酯乙醇溶液5 ml,將制得的初乳轉移到50 ml具塞量筒中,蒸餾水蕩洗3次后加水至全量,搖勻得淡黃色O/W型乳劑。

2.1.2 處方優化 通過預實驗和單因素實驗確定了呋塞米乳劑初乳制備過程中乳化劑OP、甘油的用量以及油水體積比的范圍,考慮到三者之間可能存在交互作用,因而選取L9(34)正交表進行實驗(見表1),以穩定常數作為考察指標,利用SPSS軟件進行多因素方差分析,考察影響乳劑穩定性的因素,確定最優處方。

表1 呋塞米乳劑正交實驗因素水平表

由表2可知,制備初乳時乳化劑OP的用量對乳劑穩定性有顯著影響(P<0.05),三個因素之間不存在交互作用;由表3可知,乳化劑OP為0.4 ml、甘油為6.0 ml、菜籽油 ∶水為1 ml ∶4 ml時穩定常數平均值最小,穩定常數越小代表乳劑穩定性越好,因此確定呋塞米初乳最佳用量為乳化劑OP 0.4 ml、甘油6.0 ml、菜籽油與水的體積比為1 ∶4。

表2 呋塞米乳劑正交實驗方差分析表

表3 呋塞米乳劑三因素不同水平的穩定常數估計平均值

2.1.3 呋塞米乳劑穩定性評價

2.1.3.1 穩定常數 取呋塞米乳劑10 ml置于15 ml離心管中,4 000 r/min離心15 min后,從離心管底部取出1 ml乳劑,稀釋至50 ml,以蒸餾水為對照,于500 nm波長處測得吸光度A;另取原乳劑1 ml,稀釋至50 ml,于500 nm波長處測得吸光度A0,穩定常數Ke=(A0-A)/A0×100%。Ke越小,乳劑越穩定。優化后的處方制備得的乳劑Ke為27.7%。

2.1.3.2 粒徑大小及分布 呋塞米乳劑2 ml,加水2 ml混勻后置于光學顯微鏡下觀察,平均粒徑約為25 μm。

2.1.3.3 分層現象 半徑為10 cm的離心機,4 000 r/min離心15 min,無分層,常溫下放置2 h,無分層。

2.1.3.4 乳滴合并速度 取呋塞米乳劑2 ml,加水稀釋后置于顯微鏡下觀察,分別記錄0,1,2,3,4 h同一視野中的乳滴數量,根據lgN=Kt/2.303+lgN0,繪制t-lgN直線,得到乳滴合并速度常數為0.182 1 h-1。

2.2 呋塞米乳劑藥代動力學研究

2.2.1 動物給藥與血漿采集 大鼠16只,隨機分為呋塞米片劑組與乳劑組,每組8只,禁食12 h,自由飲水。按照2 mg/kg灌胃給藥。呋塞米片劑組給予呋塞米混懸液(呋塞米片劑研細過80目篩,加入0.5%羧甲基纖維素鈉,渦旋混勻),呋塞米乳劑組給予自制的呋塞米乳劑。分別于給藥后12個時間點眼眶后靜脈取血,每次0.2-0.3 ml,置于預先加入肝素抗凝的離心試管中,以4 000 r/min離心10 min,分離上清液。-20 ℃保存,使用時取出解凍。

2.2.2 色譜條件 Agilent Zorbax色譜柱(5 μm,250 mm×4.6 mm);流動相:0.2%冰醋酸水溶液(A),乙腈(B);梯度洗脫程序(0-6 min,40%-40% B;6-15 min,40%-90% B),流速:1.0 ml/min;進樣量:20 μl;檢測波長271 nm;溫度:常溫。

2.2.3 血漿樣品處理 精密量取血漿樣品100 μl,置于1.5 ml離心管中,精密加入300 μl 2%醋酸/乙腈溶液,渦旋混勻2 min后,以10 000 r/min離心10 min,分離上清液,經0.45 μm針頭式過濾器過濾,進入HPLC分析。

2.2.4 血漿樣品方法學考察

2.2.4.1 血漿樣品專屬性試驗 空白血漿、空白血漿加呋塞米對照液、大鼠呋塞米混懸液灌胃后血漿,精密量取100 μl,按照“2.2.3血漿樣品處理”的方法進行,進入HPLC分析,得到空白血漿、加樣血漿以及服藥血漿色譜圖(見圖1)。結果表明:呋塞米色譜峰分離度良好,對稱性達到要求,理論塔板數大于6 000,藥物的測定不受內源性物質的干擾。

A.空白血漿 B.對照品(空白血漿加呋塞米)C.服藥血漿圖1 空白血漿、對照品血漿及服藥血漿色譜圖Figure 1 HPLC of blank plasma, control plasma and drug plasma

2.2.4.2 血漿樣品標準曲線和定量限試驗 取空白血漿50 μl,配制成濃度分別為0.2,1,2,4,8,12.5,25 μg/ml的呋塞米血漿樣品,混合均勻,按照“2.2.3血漿樣品處理”的方法處理,進入HPLC分析。以呋塞米對照品的峰面積(Y)對血漿濃度作線性回歸得標準方程為:Y=16.90X-4.663(r=0.993 1)。結果表明,在0.2-25 μg/ml范圍內,線性關系良好。檢測標準曲線最低點時,準確度在85.7%-103.5%內,RSD小于10.4%,說明0.2 μg/ml可為呋塞米血漿的定量下限。

2.2.4.3 血漿樣品精密度與回收率試驗 取空白血漿50 μl,配置成呋塞米濃度分別為1,4,25 μg/ml的樣品,每個濃度做5份,按“2.2.3血漿樣品處理”操作,進入HPLC分析。根據標準曲線方程計算藥物濃度,從而計算3 d內低、中、高濃度的呋塞米日內和日間精密度。結果表明,日內精密度RSD小于6.4%,日間精密度小于10.5%。

取呋塞米標準溶液,加空白血漿50 μl,配置成質量濃度分別為1,4,25 μg/ml的樣品,每個質量濃度各3份,按照“2.2.3血漿樣品處理”項下方法處理,進入HPLC分析,記錄峰面積A1。另外取空白血漿50 μl,按照血漿樣品處理方法制得上清液,用上清液配置對應濃度的呋塞米對照品,進入HPLC分析,記錄峰面積A2。計算A1/A2,即為提取回收率。結果表明,提取回收率為在84.6%-100.3%之間(見表4)。

表4 大鼠血漿呋塞米日內精密度以及日間精密度

2.2.4.4 血漿樣品基質效應試驗 取空白血漿50 μl,按照“2.2.3血漿樣品處理”項下方法處理得到空白上清液,用上清液配置呋塞米對照品,使其濃度分別為1,4,25 μg/ml(n=3),進入HPLC分析,得到峰面積均值。另外直接配置對應濃度的呋塞米對照品,得到峰面積,二者的比值即為基質效應。結果顯示,低、中、高濃度的基質效應分別為101.3%,98.6%和105.5%。

2.2.4.5 血漿樣品穩定性試驗 取空白血漿50 μl,配置其血漿濃度分別為1,4,25 μg/ml低、中、高3個水平,每個濃度平行各6份,按照“2.2.3血漿樣品處理”項下方法處理,進入HPLC分析,記錄峰面積。考察呋塞米血樣在室溫放置12 h,-80 ℃保存30 d,以及反復凍融3次的穩定性。結果顯示,室溫放置12 h的RSD為9.9%,5.6%和3.3%。-80 ℃保存30 d的RSD為10.8%,2.3%和5.7%。反復凍融3次的RSD為10.3%,9.3%,和8.6%。結果表明呋塞米在血樣中穩定。

2.3 呋塞米血藥濃度測定及藥動學參數的計算

按照“2.2.1動物給藥與血漿采集”,在給藥后的0.25,0.5,1,1.5,2,2.5,3,4,6,8,10,12 h時間點取血,保存血樣。按照“2.2.3血漿樣品處理”方法處理,進入HPLC分析,得到各時間點血藥濃度。繪制呋塞米片劑和乳劑的血藥濃度-時間曲線。結果見圖2。

圖2 呋塞米乳劑和片劑的藥時曲線Figure 2 Comparison of blood concentration-time curves of furosemide emulsion and tablet

采用DAS 2.0藥動學軟件包對血藥濃度自動擬合,計算相關藥代動力學參數。其中,達峰濃度Cmax,達峰時間Tmax為實測值,藥時曲線下面積AUC采用對數梯形法計算,結果見表5。結果表明,與片劑組相比,乳劑組達峰時間和片劑組相當,達峰濃度增高,藥-時曲線下面積增大,表觀分布容積以及口服清除率均減小。利用“兩個獨立樣本檢驗”對片劑和乳劑組各參數進行Manner-Whitney分析,漸近顯著性(雙尾)顯示兩種劑型達峰濃度Cmax、藥時曲線下面積AUC、清除率CLz/F、表觀分布容積Vz/F差異有統計學意義(P<0.05)。

表5 主要藥代動力學參數 (n=8)

3 討論

3.1 處方優化

處方中甘油可改善菜籽油被水潤濕的性能,同時增加乳劑黏性和稠度;無毒的乳化劑OP廣泛應用于醫藥領域;尼泊金乙酯醇為防腐劑,為使其分散均勻,應在攪拌研磨下滴加[3,4];制備過程中應盡量避免出現氣泡,以免影響乳化效果[5]。質量評價表明,通過處方優化的呋塞米乳劑均勻穩定,載藥量高。

3.2 含量測定方法的建立

在建立乳劑中呋塞米的含量測定方法中,通過超聲破乳,4%氫氧化鈉溶液溶解所得到的液體,其在呋塞米的最大吸收波長處,輔料的干擾比較大。隨后采取HPLC分離后,能夠排除乳劑中其他物質的干擾。在選擇流動相時,本論文嘗試了幾種流動相體系后證明,在0.2%醋酸溶液-乙腈的條件下,色譜峰對稱性良好,保留時間適中。在后期的血漿樣品分析中,同樣適用。

血漿樣品的前處理方式中,加入3倍體積的2%醋酸/乙腈溶液沉淀蛋白。醋酸,有利于蛋白沉淀,藥物游離[6]。同時,加入醋酸還能抑制呋塞米電離,改善色譜峰對稱性[7,8]。結果顯示提取回收率和峰的對稱性均良好。

3.3 呋塞米乳劑和片劑藥代動力學數據分析

通過呋塞米乳劑組和片劑組藥-時曲線,可以看出乳劑組血藥濃度和片劑組的達峰時間相當,但乳劑組的峰濃度明顯高于片劑組,曲線下面積增大。說明呋塞米乳劑被胃腸道吸收的更多。可能的原因是乳劑粒徑較小,接觸面增大,促進了胃腸道的吸收。另外,呋塞米乳劑在0.5 h有個小峰后,2.5 h第2次出現最大峰。可能的原因是部分未包裹進乳滴的藥物游離出來被吸收,產生突釋效應,吸收程度大大增加,有利于患者吸收。

呋塞米常見的劑型包括片劑和注射劑,其主要問題為溶解性和滲透性差,生物利用度個體差異大。除了環糊精包合、微球、膜劑,較少見文獻報道呋塞米的其他劑型[9]。而乳劑載藥量大,液滴小,滲透性強,生物利用度高,使用過程中少量劑量即能達到與片劑相同效果。同時,乳劑在口感調整上有優勢,更加容易被嬰幼兒患者接受,提高用藥的依從性。因此,本文的研究結果,為呋塞米劑型開發提供了理論基礎,具有應用前景。