湛江等鞭金藻藻際細菌群落與其耐高溫關系分析

陳 珂 王瑩瑩 楊 悅 曹嘉懿 曹旭鵬 徐繼林

(1寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211；2中國科學院大連化學物理研究所催化基礎國家重點實驗室，遼寧 大連 116023)

海洋微藻具有生長周期短、生物量產率高、營養組成豐富、培養占地面積小等特點，近年在養殖飼料、生物能源、生態治理、食藥保健等領域備受關注[1-3]。湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis)作為一種無細胞壁、易培養且營養價值特殊(富含二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸)的海洋微藻，在水產養殖領域已有大規模的應用[4]，尤其在我國南方的大規模海水貝類工廠化育苗中，其作為一種重要的海水貝類幼苗開口餌料應用[5-7]。金藻的最適宜生長溫度為25℃[8]，然而我國南方夏季藻類培養池水體溫度能達到35℃[9]，夏季高溫嚴重制約了金藻的生長和擴繁，從而導致較高的生產成本和風險。

目前已有關于藻類高溫響應機制的研究，如在多細胞藻類海帶中發現細胞膜結構對高溫存在響應，高溫使海帶體內的活性氧含量增高，細胞膜的通透性增加，從而影響到海帶細胞體內的抗氧化系統活性[10]；在石莼中，熱激應答元件(heat shock element，HSE)和低溫響應元件(low temperature responsive element，LTR)因子可能是適應高溫潛在分子熱激蛋白70 基因(hsp70)的靶點，其下游的靶基因所編碼的熱激蛋白會對細胞器的膜系統穩定性和功能加以保護[11]；在微藻細胞中，高溫抑制了光系統Ⅱ(PS Ⅱ)的電荷分離活性，鈍化了PS Ⅱ的氧化能力[12]。研究還發現，微藻藻際微生物組成與藻類生長之間存在重要聯系，它能夠參與調控藻類的生長、營養組成、代謝產物分泌等重要的生命活動[13-15]。進一步研究發現，高溫脅迫條件下原核微生物與其共生藻類形成的微環境能為珊瑚宿主提供一種適應高溫脅迫的補償機制，這些原核微生物能夠通過光合作用、固定碳源等方式增強珊瑚本身的耐熱性[16-17]。且目前已在番茄和高粱中發現，根瘤菌可以增強植物高溫抗逆性[18-19]。但在微藻耐高溫性狀與其藻際微生物群落間關系方面的研究仍然有限，因此解析藻際細菌與微藻耐高溫能力之間關聯的研究具有重要意義。本試驗以湛江等鞭金藻及其耐高溫誘變株為研究對象，運用16S rDNA 擴增子測序技術比較了這兩株藻在高溫條件(35℃)下藻際微生物組成的差異，解析微生物組成與耐高溫能力的關系，以期為提高水產養殖過程中餌料微藻的高溫抗逆性提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養條件

湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis，IZ)，保藏編號為FACHB-1750，由中國科學院水生生物物種種質庫提供。湛江等鞭金藻耐高溫誘變株(IM)由中國科學院大連化學物理研究所采用常壓室溫等離子體技術誘變篩選獲得[20]。兩株湛江等鞭金藻在無菌寧大三號(NMB3＃)固體培養基純化并保存[21]。

兩株金藻均培養在光照培養箱中，置于正常培養溫度(25℃)和高溫(35℃)下培養，光照強度為4 000 lx，光周期為光∶暗=12 h∶12 h。培養基采用NMB3＃配方培養基，培養所需海水均高溫滅菌處理冷卻后使用。

1.2 藻細胞生長曲線測定及樣品采集

藻細胞計數主要采用血球計數法[22]。將藻液用盧戈碘液固定后取40 μL 混勻的藻液均勻滴入蓋有蓋玻片的血球計數板中，放置在光學顯微鏡(Olympus，日本)觀察并計數，目鏡放大10 倍，物鏡放大40 倍，每天計數一次。

根據兩株金藻的生長情況，分別在25℃和35℃條件下取第3 天指數生長時期的藻液50 mL，收集25℃野生株組(IZ25L)、25℃誘變株組(IM25L)、35℃野生株組(IZ35L)和35℃誘變株組(IM35L)藻液，各組分別收集3 個重復樣品。將所有樣品依次通過0.22 μm的聚碳酸酯膜(Millipore，美國)進行無菌過濾，獲得藻際細菌，將收集好的濾膜分別放置于不同的無菌離心管中液氮速凍保存。

1.3 樣品基因組DNA 的提取及PCR 擴增與高通量測序

采用CTAB 法對所有樣本的基因組DNA 進行提取，提取后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度。將獲得的合格基因組DNA 送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行后續PCR 擴增及測序。以稀釋后的基因組DNA 為模板，選擇各樣本總DNA 上16S rDNA 基因的V3-V4 高變區序列擴增，使用帶Barcod的引物 341F (CCTAYGGGRBGCASCAG) 和 806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT)進行PCR 擴增。PCR產物使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據PCR產物的濃度將樣品進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，使用德國QIAGEN 公司膠回收試劑盒回收目的條帶的產物。文庫構建使用 TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒(諾禾致源，北京)進行，而后通過Qubit(Thermo Scientific，美國)檢測和Q-PCR(quantitative real-time PCR)定量構建合格文庫進行測序。

1.4 測序數據處理與分析

基于Illumina NovaSeq 測序平臺，利用Qiime 軟件對原始下機數據進行過濾，得到質量較高的有效數據[23]。利用Uparse 軟件將所有樣本的有效數據進行操作分類單元(optional taxonomic unit，OTU)聚類，同時篩選聚類相似度為97%[24]中出現頻率最高的OTU作為其代表序列。采用Mothur 方法對獲得的OTU 代表序列進行物種分類學處理(設定閥值為0.8)，參照SILVA 的SSUrRNA 數據庫進行物種比對注釋[25]，注釋時刪除古細菌、葉綠體和未知序列。為消除因測序深度不同引起的樣本間多樣性評估偏差，對各樣本的數據進行均一化處理，以其中數據量最少的樣本為標準進行均一化處理，后續基于均一化處理的數據進行Alpha 多樣性分析和Beta 多樣性分析。

1.5 藻際可培養細菌分離與鑒定

將生長狀態良好的藻液按照藻液∶培養液=1∶9(體積比)的比例進行稀釋，稀釋至細胞密度為10-1～10-5，取100 μL 的各稀釋濃度樣品用平板涂布法均勻涂布在2216E 固體平板培養基上。將平板放置于28℃恒溫培養箱內培養數日，每日觀察平板的細菌生長情況(菌落顏色、形態和大小)，再挑取可操作的單一菌落置于新的2216E 固體培養基中進行劃線法純化，最終得到單克隆菌株。

對分離所獲得的各菌株，采用細菌基因組DNA 提取試劑盒分別進行提取。以提取后的總DNA 為模板，27F(5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)為引物進行PCR 擴增，擴增反應體系及條件參考孔周雁等[26]的方法。將PCR 擴增后的產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用凝膠回收試劑盒純化，并連接至pMD19-T 載體后送至杭州有康生物技術有限公司測序。將從公司所測得的16S rDNA 基因序列全長輸入NCBI 網頁進行BLAST 比對同源相似性最高的物種序列。

1.6 統計分析

MetaStat 分析使用R 軟件在種水平下，做組間的置換檢驗，得到p 值，然后利用Benjamini and Hochberg False Discovery Rate 方法對于p 值進行修正，得到q值[27]。利用SPSS 軟件進行統計分析，對湛江等鞭金藻生長指標進行獨立樣本t檢驗。

2 結果與分析

2.1 高溫條件下湛江等鞭金藻野生株和突變株生長差異比較

在25℃和35℃條件下野生株IZ 與誘變株IM 之間的生長曲線如圖1所示。由圖1-A 可知，在25℃培養條件下，野生株與誘變株生長趨勢基本相同，且藻的細胞密度無顯著差異；在35℃培養條件下，野生株與誘變株生長趨勢基本相同，但誘變株IM 每天的藻細胞密度高于野生株IZ，且在第4～第10 天差異顯著，說明在35℃下誘變株IM 的高溫耐受性明顯強于野生株IZ。

2.2 高通量測序數據統計與分析

4 組樣品測序共計獲得804 756 條有效序列，組間平均有效序列獲得率為69.64%～75.20%，表明各組測序結果能基本反映各組樣本中的大多數細菌類群情況(表1)。在指數生長期，25℃下兩株藻細菌類群的Chao1 指數和ACE 指數無顯著性差異，但誘變株的藻際細菌類群的Shannon 指數和Simpson 指數顯著高于野生株；35℃下兩株藻細菌類群的Shannon 指數和Simpson 指數無顯著性差異，但誘變株的Chao1 指數和ACE 指數顯著高于野生株。這說明指數期溫度升高可促使誘變株藻際細菌豐富度顯著增加。

OTU 聚類結果顯示4 組樣本中共有OTU 數量為87 個，其中IM35L 組中的特有OTU 數量遠高于其他組別(圖2)，進一步說明該組的藻際細菌豐富度最高。

2.3 藻際細菌群落多樣性分析

表1 各樣品組所檢測到的有效數據及多樣性指數Table 1 The effective tags and diversity indices of each sample group

在OTU 水平上，基于Binary-Jaccard 距離對所有樣本進行無度量多維標定法(non-metric multidimensional scaling，NMDS)分析，其中橫坐標為MDS1，縱坐標為MDS2，且該NMDS 的Stress 值為0.086，小于0.2，說明NMDS 可以準確反映樣本間的差異程度(圖3)。在MDS1 維度中四組樣品點，組內樣品差異基本小于組間樣品差異，能夠較為直觀地反映四組樣品間的差異。25℃下兩株金藻樣本點聚集在MDS1 的負半軸，且整體較為聚集，說明25℃下兩株金藻的藻際細菌群落多樣性較為相似。但35℃下，IM 和IZ 樣本點分別位于MDS1 的正負半軸且兩組樣本點組間較為離散，說明35℃下兩株金藻的藻際細菌群落多樣性有明顯差異。說明高溫條件下兩株藻藻際細菌存在明顯差異。

2.4 藻際細菌群落組成差異及比較分析

在門水平上(圖4-A)，各組樣品檢測到的優勢菌種有一定的相似性，各組樣品均以變形菌門(Proteobacteria) 為主要優勢菌門，其相對豐度達91.57%～97.01%；其次為擬桿菌門(Bacteroidetes)，相對豐度達1.54%～6.28%，其他優勢菌種還包括厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)等。

在屬水平上(圖4-B)，經檢測后四組樣品中細菌群落組成差異明顯。除未知屬外(Others)，IZ25L 組、IM25L 組和IZ35L 中相對豐度最大的前三屬相同，為海桿菌屬(Marinobacter)、拉布倫茨氏菌(Labrenzia)、海洋柄菌屬(Oceanicaulis)；而IM35L 組中相對豐度最大前三屬分別是拉布倫茨氏菌(Labrenzia)、海洋柄菌屬(Oceanicaulis)和噬冷菌屬(Algoriphagus)，這說明噬冷菌屬在該組中的相對豐度明顯提高，隸屬于該屬的細菌可能與IM 的耐高溫性狀有關。

2.5 藻際細菌群落間差異物種分析

為了研究組間具有顯著性差異的物種，利用MetaStat 方法對組間的物種豐度數據進行假設檢驗得到p 值，通過對p 值的校正，得到q 值，最后根據q 值經過t 檢驗篩選得到具有顯著性差異的兩株菌種。其中，在35℃下，變形菌門紅螺菌目的阿爾法變形菌DG1252(Alpha proteobacteriumDG1252)在誘變株中的豐度顯著高于野生株，但在25℃下豐度差異不顯著，說明變形菌門的阿爾法變形菌DG1252 在高溫條件可能為促進湛江等鞭金藻誘變株生長的重要菌種；聚團拉布倫茨氏菌(Labrenzia aggregata)在25℃下兩株藻之間豐度差異顯著，但在35℃下菌種豐度差異不顯著。

2.6 湛江等鞭金藻野生型和誘變型藻際可培養細菌的分離和鑒定

使用培養基配方為2216E 的平板進行涂布平板分離法對兩種藻株的藻際細菌進行分離，經過初步分分離和鑒定得到4 株野生型的藻際細菌(編號為IZ-1、IZ-3、IZ-4 和IZ-5)和5 株誘變型的藻際細菌(IM-1、IM-2、IM-3、IM-4 和IM-5)，細菌信息及比對相似度如表2所示。其中，分離得到的海桿菌和噬冷菌等均為藻際細胞的主要細菌群落。因此，分離得到的細菌與測序分析獲得的結果基本一致，一定程度上驗證了測序結果的可靠性。

表2 從湛江等鞭金藻野生株(IZ)和湛江等鞭金藻誘變株(IM)分離的藻際細菌信息Table 2 The information of bacteria isolated from wildstrain I.zhangjiang(IZ) and mutant strain I.zhangjiangensis(IM)

3 討論

通過比較湛江等鞭金藻野生型和誘變型藻株在25℃和35℃的生長情況，發現兩株藻在25℃條件下的生長差異并不明顯；但在35℃條件下，誘變株的生長情況明顯優于野生型。已有很多研究發現藻際微生物對微藻至關重要[14，28-29]，然而鮮有研究解析其是否與微藻耐高溫能力存在關聯。因此，本試驗以湛江等鞭金藻及其耐高溫誘變株為研究對象，運用16S rDNA擴增子測序技術比較了這兩株藻在正常培養溫度(25℃)和高溫條件(35℃)下藻際細菌組成的差異，解析了藻際細菌組成與耐高溫能力的關系。

兩株湛江等鞭金藻在不同溫度條件下藻際細菌門水平組成上較為相似，其中主要優勢菌門是變形菌門和擬桿菌門，其次是擬桿菌門和厚壁菌門。目前已有研究發現變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門是藻際細菌群的重要菌群組成[26，30-32]。另外，對比不同溫度下的屬水平細菌組成發現，海洋柄菌和Glycocaulis的相對豐度在35℃下普遍高于相對應的25℃。這在微小亞歷山大藻中也有同樣的發現，溫度升高對其藻際細菌群落改變的主要表現之一就是海洋柄菌的細菌豐度提升了17%[33]；Abraham 等[34]研究發現一種與海洋柄菌親緣關系最接近、適宜30℃的耐高溫Glycocaulis細菌，這也驗證了本研究在高溫下發現的屬水平藻際細菌群落差異。另外，本研究發現上述兩個差異屬在上一級的分類單位中屬于同一科(生絲單胞菌科，Hyphomonadacea)，而近年來全球變暖的情況導致了該科水平細菌在海洋中的豐度上升[35]。藻際細菌組成在屬水平上差異較大，主要是IM35L 組中噬冷菌屬細菌相對豐度明顯高于其他三組。因此溫度的升高會造成水體中藻際微生物群落的變化，結合兩株藻在25℃和35℃下的生長情況來看，噬冷菌屬細菌的相對豐度差異可能是湛江等鞭金藻誘變株在35℃下生長更好的原因之一。

為進一步分析35℃下兩株藻間生長差異，明確具有顯著性差異的細菌物種，采用MetaStat 方法對所有組間差異物種在種水平上進行分析，發現除未知種外在組間具有顯著性差異豐度的細菌共計兩種。其中變形菌門紅螺菌目細菌阿爾法變形菌DG1252 在25℃下野生株組和誘變株組的豐度無明顯差異，但在35℃下誘變株組的豐度顯著高于野生株組。目前已有研究表明該目的模式物種深海紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)在71℃下仍能進行光合作用，且該現象在同一門水平都具有廣泛的適用性[36]。因此推測阿爾法變形菌DG1252 在35℃下可能是提高湛江等鞭金藻誘變株高溫耐受性的重要菌種。但該微生物在高溫下能否增強藻類對高溫的耐受性還有待深入驗證。

本研究對兩株藻的藻際細菌進行進一步分離與鑒定，分別從IZ 和IM 中分離鑒定了4 株和5 株藻際細菌，其中包括2 株噬冷菌屬細菌，但未分離得到阿爾法變形菌DG1252，這可能是由于本研究采取單一的培養基分離藻際細菌具有一定的局限性，造成一些重要細菌未分離到。因此，為進一步解析這些細菌與湛江等鞭金藻耐高溫性狀的關系，需要增加分離細菌的培養基類型來鑒定分離更多藻際細菌；此外，將兩株湛江等鞭金藻藻株先進行無菌純化處理，再將除菌后的藻株與分離得到的噬冷菌屬菌株進行共培養試驗，有助于進一步驗證其與湛江等鞭金藻耐高溫性狀的關系。

4 結論

本研究基于16S rDNA 擴增子測序技術，分析了湛江等鞭金藻野生株和誘變株藻際細菌多樣性及其耐高溫性狀的聯系。結果表明，25℃下兩株藻的藻際細菌群落差異小，但在35℃高溫下培養的兩株藻藻際細菌群落組成差異明顯。進一步分析發現，噬冷菌屬細菌和阿爾法變形菌DG1252 在兩株藻中的相對豐度在25℃下無顯著差異，但在35℃下誘變株相對豐度顯著高于野生株，兩者可能與湛江等鞭金藻誘變株高溫耐受性相關。此外，本研究分離并鑒定了包括噬冷菌屬細菌在內的9 株藻際細菌，但未能分離阿爾法變形菌DG1252。后續可對藻際細菌進行分離鑒定并進行共培養試驗，以驗證其與湛江等鞭金藻耐高溫性狀的關系。本研究為金藻高溫抗逆性和藻際細菌多樣性的關系探索提供了新方向，有助于夏季高溫條件下水產養殖過程貝類餌料微藻的培育和擴繁。