基于生物酶法的酰基化桑椹花青素的制備與特性

蔣希芝，徐 磊，張 蓓，辛向東，Thomas Attaribo，桂仲爭※

（1. 江蘇科技大學生物技術學院，鎮江 212018；2. 農業農村部長江中下游設施農業工程重點實驗室，江蘇省農業科學院農業設施與裝備研究所，南京 210014；3. 江蘇銀寶農業科學研究院有限公司，鹽城 224014）

0 引 言

桑椹為多年生木本植物桑樹（Morus albaL.）的成熟果穗，又名桑葚子、桑果、桑棗等。桑椹不僅含有豐富的維生素、氨基酸、礦物質等營養元素，而且富含多種具有生物活性的化合物，如黃酮、生物堿、多糖等多種生物活性成份[1-2]。花青素是桑椹中含量豐富的重要活性成分之一，也是天然色素的重要來源之一[3]。花青素是具有親水性和水溶性的多酚類植物色素及其代謝產物，是重要的抗氧化劑之一[4-5]，具有廣泛的藥理特性，如抗氧化、抗衰老、抗炎、抗菌和抗癌[6-10]，因此，在醫藥、食品等領域具有巨大的應用潛力[11]。桑椹果實中花青素主要有4種存在形式，分別為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷（P3G）、矢車菊素-3-O-蕓香苷（C3R）和天竺葵素-3-O-蕓香苷（P3R）。C3G和C3R是桑椹花青素中的主要成分[12]。

然而，花青素在加工過程中很不穩定，易受多種不同外部條件影響[13-14]。溫度和光照是影響花青素降解穩定性的重要因素，顯著降低其穩定性和生物活性[15]。Fracassetti等[16]觀察發現花青素在25和42 ℃下的前14 d降解量緩慢，為3%，而在60和80 ℃下的第3天則降解很快，分別為60%和85%。加熱處理可將花青素或其結合糖苷分解成小分子，如醛類、苯甲酸衍生物或同義花青素[17]。影響花青素穩定性的另一個重要因素是pH值。Rein等[18]證明，花青素水溶液在不同的pH值下存在4種形式的相互轉化，導致不同顏色的存在。特別是在弱酸性到中性范圍內，穩定性大大降低。此外，金屬離子[19]、糖含量[20]和過氧化氫[21]也會影響花青素的穩定性。因此，花青素相對較低的穩定性是限制其廣泛有效應用的關鍵缺陷和主要障礙[22-24]，盡可能減少花青素的降解，提高其穩定性尤為重要。

為了提高花青素的穩定性，已報道的修飾方法有糖基酰基化[25]、糖基化[26]、微膠囊化[27]、金屬螯合[28]、脂質體[29]和納米粒子載覆[30-31]。從營養學角度分析，普通的化學修飾定向性差，而生物酶法反應過程不會對花青素分子造成破壞，具有更高的安全性，更符合農業食品安全要求，而且生物酶具有高度選擇性和專有性。因此，生物酶法更適合對花青素分子進行酰基化修飾[32]。目前，有關生物酶法對桑椹花青素酰基化修飾鮮有報道。

因此，本研究選取成熟桑椹果實，提取純化制得桑椹花青素。采用生物酶法，對制備的桑椹花青素進行酰基化反應，并與非酰基化的花青素進行對比分析，考察脂肪酶、反應溶劑、酰基供體對花青素酰基轉化率的影響，并對產物進行分析。此外，進一步分別研究溫度、光照、pH值等條件對酰基化花青素結構和性能的影響，測定酰基化花青素的抗氧化活性，包括清除DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基能力、總還原能力、Fe2+鰲合能力等，并與合成前花青素進行比較，探討酰基化對花青素穩定性和抗氧化活性的影響，從而為花青素在功能性食品、生物醫藥和植物源農藥、日用化妝品等生產領域中的應用提供參考的理論依據和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

供試桑椹，采自江蘇省鎮江市江心洲中國農業科學院蠶業研究所國家桑資源圃基地。所摘桑椹為成熟度相近，形狀大小均一，無霉爛變質，無病蟲害的新鮮桑椹。

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（C21H21ClO11）標準品由上海麥克林生化科技有限公司提供；甲醇、乙腈，均為色譜純，購于德國默克公司；南極假絲酵母脂肪酶、Amano脂肪酶PS購于美國Sigma公司；米曲霉脂肪酶購于美國Aladdin公司；豬胰腺脂肪酶、大孔吸附樹脂（D101）、無水乙醇、吡啶、叔丁醇、叔戊醇、丙酮、苯甲酸甲酯、水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒食子酸甲酯、4A分子篩、氯化鉀、檸檬酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵均購于國藥集團化學試劑有限公司，鹽酸購于上海中試化工總公司，以上試劑均為分析純；DPPH購于日本TCI公司，三氯乙酸、菲洛嗪購于上海生工，氯化亞鐵購于沃凱，以上試劑均為生化試劑。

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-ⅡD超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-3200PC紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；Nicolet iS50傅里葉紅外光譜儀，美國Thermo；HPLC 1260Ⅱ高效液相色譜儀，美國Agilent；LC 1260 MS G6420A高效液相色譜串聯質譜分析儀，美國Agilent；QTRAP 6500質譜分析儀，美國SCIEX。

1.3 試驗方法

1.3.1 生物酶催化合成酰基化花青素

采用生物酶法對制備的桑椹花青素進行酰基化反應。

選取南極假絲酵母脂肪酶（5 000 U/g）、Amano脂肪酶PS（Pseudomonas，30 000 U/g）、米曲霉脂肪酶（300 000 U/g）、豬胰腺脂肪酶（500 U/g）作為輔助花青素酰基化的催化酶，反應體積共10 mL，花青素20 mg、苯甲酸甲酯0.5 mol/L，分別加入酶活力1 000 U的不同的脂肪酶，吡啶2 mol/L，干燥活化4A分子篩1 g，40 ℃恒溫振蕩反應12 h。

選取吡啶、叔丁醇、叔戊醇、丙酮作為酶催化酰基化反應溶劑，反應體積共10 mL，花青素20 mg，苯甲酸甲酯0.5 mol/L，酶活力1 000 U南極假絲酵母脂肪酶，分別加入吡啶、叔丁醇、叔戊醇、丙酮2 mol/L，干燥活化4A分子篩1 g，40 ℃恒溫振蕩反應12 h。

選取苯甲酸甲酯、水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒食子酸甲酯作為酰基供體，反應體積共10 mL，花青素20 mg，加入苯甲酸甲酯、水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒食子酸甲酯各0.5 mol/L，酶活力1 000 U南極假絲酵母脂肪酶，吡啶2 mol/L，干燥活化4A分子篩1 g，40 ℃恒溫振蕩反應12 h。

1.3.2 高效液相色譜分析花青素含量

樣品在去離子水中稀釋后，進入配有四元泵、自動進樣器和DAD檢測器的高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）。在20 ℃下，使用反相色譜柱（Poroshell 120 EC-C18，4.0μm，4.6 mm×150 mm）測定花青素的含量。設置流速0.8 mL/min，進樣量2.0μL。流動相為1%甲酸水溶液（A）和1%甲酸乙腈溶液（B）。試驗在以下條件下進行：0～2.50 min，線性梯度從8%到12%B；2.50～5.00 min，線性梯度從12%到18%B；5.00～10.10 min，線性梯度從18%到20%B；10.10～12.00 min，線性梯度從20%到80%B；12.00～14.00 min，80%B；14.00～14.10 min，線性梯度從80%到8%B；14.10～18.00 min，8%B；最后，在下一次注射之前清洗并重新平衡色譜柱。分析期間，所有樣品均保持在4 ℃，于520 nm處檢測花青素。

1.3.3 花青素轉化率和保留率測定

花青素酰基化轉化率：采用高效液相色譜（HPLC）測定花青素酰基化反應后的出峰面積，根據公式（1）計算轉化率[32]：

式中C為花青素酰基化轉化率；S1為反應后液相色譜中C3G的出峰面積；S2為反應后新生成的C3G酰基化產物的出峰面積。

花青素保留率：采用高效液相色譜（HPLC）分別測定花青素酰基化前后的出峰面積，根據公式（2）計算保留率[32]：

式中P為花青素酰基化保留率；S0為反應前液相色譜中C3G的出峰面積。

1.3.4 酰基化花青素的結構分析

利用傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier Transformation Infrared Spectra，FTIR）和紫外-可見光風光光度計進行酰基化結構的初步分析。在衰減全反射模式（Attenuated Total Reflection mode，ATR）下，用Nicolet-iS50紅外光譜儀對復合前后樣品的特征吸收峰進行了表征。其中，波數范圍為525～4 000 cm-1，溫度為25 ℃。

借助紫外可見分光光度計（Ultraviolet-Visible Spectrophotometer，UV-Vis）對花青素溶液進行漫反射光譜測定，波長范圍200～600 nm，掃描速度中等，狹縫寬度20 nm，采樣間隔2.0 nm。

1.3.5 穩定性試驗

熱穩定性：用去離子水將酰基化和未酰基化的花青素稀釋到相同濃度，pH值調為5。在室溫下平衡1 h后，取相同體積溶液避光密封于離心管中，分別在40、50、60 ℃的溫度下，避光水浴熱處理12 h，研究溫度對花青素穩定性的影響。采用紫外-可見光分光光度計，在520 nm處測定花青素含量。根據公式（3）計算花青素保留率[33]：

式中R為花青素保留率；A0為加熱開始時的吸光度（t=0）；At為時間t時的吸光度。

光穩定性：用去離子水將酰基化和未酰基化的花青素稀釋到相同濃度，pH值調為5。在室溫下平衡1 h后，取相同體積溶液置于離心管中，在450 W熒光燈照射箱中光照處理12 d，溫度20 ℃，每2 d取樣測試花青素含量變化，計算花青素保留率，考察不同光照對花青素穩定性的影響[33]。

pH穩定性：選取pH值范圍2至9，每100 mL緩沖溶液中溶解15 mg花青素。緩沖劑：0.1 mol/L氯化鉀溶液作為pH值為 2的緩沖液；0.1 mol/L檸檬酸溶液作為pH 值為3和4的緩沖液；0.1 mol/L磷酸鹽溶液作為pH值為 5、6和7的緩沖液；0.1 mol/L磷酸鹽-氫氧化鈉溶液作為pH值為 8和9的緩沖液。計算花青素含量變化，分析pH值對花青素穩定性的影響。

1.3.6 抗氧化性試驗

DPPH自由基清除能力：稱取一定量的DPPH，用無水乙醇配制成0.1 mmol/L的DPPH溶液。分別取0.2 mL不同濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）的溶液，加入0.4 mL DPPH溶液，混合均勻，室溫放置30 min后，5 000 r/min離心10 min。取上清液于517 nm處測吸光值。用VC作為陽性對照。樣品對DPPH自由基的清除率利用公式（4）計算[34]：

式中Ad0為0.2 mL無水乙醇+0.4 mLDPPH溶液的吸光值；Ad1為0.2 mL樣品溶液+0.4 mLDPPH溶液的吸光值；Ad2為0.2 mL樣品溶液+0.4 mL無水乙醇的吸光值。

總還原能力：在離心管中分別加入0.2 mol/L pH值為6.6的磷酸緩沖液0.25mL和不同濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）的溶液0.2 mL，加入0.25 mL 1%鐵氰化鉀，混合均勻后于50 ℃反應20 min。取出后加入0.25 mL 10%三氯乙酸終止反應，5 000 r/min離心10 min。取上清液加入0.2 mL蒸餾水和0.05 mL 0.1%FeCl3，混勻后靜置10 min，在700 nm處檢測吸光值。VC作為陽性對照[34]。

Fe2+鰲合能力：分別取0.4 mL不同濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）的溶液，加入2 mmol/L的FeCl2溶液0.1 mL和5 mmol/L的菲洛嗪溶液0.2 mL，25 ℃水浴10 min，于562 nm處測吸光值，EDTA為陽性對照。樣品對Fe2+鰲合率利用公式（5）計算[34]：

式中Af0為0.4 mL蒸餾水+0.1 mLFeCl2+0.2 mL菲洛嗪吸光值；Af1為0.4 mL樣品+0.1 mL FeCl2+0.2 mL菲洛嗪吸光值；Af2為0.4 mL樣品+0.1 mL蒸餾水+0.2 mL菲洛嗪吸光值。

1.3.7 MTT（Thiazolyl blue tetrazolium bromide）噻唑藍試驗

中國倉鼠卵巢上皮細胞CHO-k1活性檢測，培養基：Ham’s F-12K+10%FBS（Fetal Bovine Serum）。1）收集對數期細胞，調整細胞濃度，每孔加100μL（待測細胞密度8 000個/孔）；2）5%CO2、37 ℃培養至細胞鋪滿孔底，棄培養基，加入不同濃度梯度的待測樣品（一般下午鋪板，次日上午加藥）；樣品用純F-12K培養基（無FBS）進行梯度稀釋后，以樣品∶培養基=1∶9的比例加入96孔板（一般先加20μL樣品，再加180μL培養基）；以PBS作陰性對照；3）繼續培養16～48 h后，加入20μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續培養4 h（注意避光）；4）終止培養，棄培養基；注意不要將結晶物吸出；5）每孔加入150μL DMSO（Dimethyl Sulfoxide），置搖床低速震蕩10 min，使結晶物充分溶解，測A490 nm；6）細胞活性%=樣品吸光值/對照組吸光值×100，抑制率計算公式如（6）所示：

式中N為抑制率；An0為對照組吸光值；An1為樣品吸光值。

2 結果與分析

2.1 生物酶催化條件對花青素酰基化的影響

生物酶催化活性是影響桑椹花青素酰基化的重要因素之一，本文選取了4種脂肪酶（1-南極假絲酵母脂肪酶、2-Amano脂肪酶PS、3-米曲霉脂肪酶、4-豬胰腺脂肪酶），在相同酶活條件下，對花青素酰基轉化率和保留率進行測定分析，如圖1所示，4種脂肪酶的轉化率在10%～15%之間，其中，南極假絲酵母脂肪酶催化效果最好，酰基轉化率為13.5%，花青素保留率最高，為38.4%。其余3種脂肪酶的催化效果較為接近。

酶催化反應溶劑對桑椹花青素酰基化效果具有顯著的影響，本文選取了4種反應溶劑（吡啶、叔丁醇、叔戊醇、丙酮），圖2所示為不同反應溶劑對花青素酰基轉化率和保留率的影響。在不同反應溶劑作用下，花青素酰基轉化率差異明顯。當吡啶作為反應溶劑時，花青素酰基轉化率最高，為13.5%，而叔丁醇、叔戊醇、丙酮的酰基轉化率均低于4%，但是花青素保留率均較高，保持在50%～65%之間，這是因為以叔丁醇、叔戊醇、丙酮作為反應溶劑時，酰基化效率低，溶液中非酰基化的花青素較多，導致保留率較高。

不同的酰基供體對酰基化花青素的結構和性能影響較大，本文選取苯甲酸甲酯、水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒食子酸甲酯作為酰基供體，如圖3所示，研究了不同的酰基供體對花青素酰基轉化率和保留率的影響。由圖可得，當苯甲酸甲酯作為酰基供體時，花青素酰基轉化率最高為13.5%，水楊酸甲酯的酰基轉化率最低為8.8%。苯甲酸甲酯的花青素保留率也最高為38.4%，水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒食子酸甲酯的保留率均低于30%。

花青素的酰基化反應是將其羥基與脂肪酸以及其他物質酯化，以增強穩定性和親脂性。根據試驗結果，以轉化率為考察指標，最佳組合為南極假絲酵母脂肪酶、吡啶、苯甲酸甲酯。南極假絲酵母脂肪酶催化花青素-3-O-葡萄糖苷，這種酶促反應可以在富含花青素的提取物上進行，也可以根據修飾的物理性質進行分離，是酰基化試驗效果較為理想的催化酶[35]。在酶催化反應溶劑體系中，有機溶劑性質會影響酶的活性、選擇性、穩定性以及反應效果。由于花青素水溶性較高，親脂性極低，需采用極性較強有機溶劑使其在反應中溶解。然而，有研究表明，溶劑極性過高易降低脂肪酶分子結構穩定性和酶催化活性[32]。因此，選用吡啶作為反應中使用的極性有機溶劑，既能較好的溶解桑椹花青素，又能保持酶催化活性。對復雜的桑椹提取物進行提取和純化，再以提純的桑椹花青素為基體，通過酶法酰基化，以轉化率為考核指標時，苯甲酸甲酯對花青素的酰基化轉化效率最高，這可能和花青素的多種結構有關。

2.2 酰基化花青素結構分析

采用傅里葉紅外光譜儀在525至4 000 cm-1的吸收光譜范圍內對非酰基化花青素和酰基化花青素進行基團分析，如圖4a所示，非酰基化花青素在3 262～3 325 cm-1處為酚羥基上-OH寬而強的伸縮吸收峰，2 981 cm-1處為糖環亞甲基上C-H的伸縮振動吸收峰，1 638 cm-1為苯環的特征吸收峰，1 043 cm-1為C-O伸縮振動相對應。與非酰基化花青素相比較，酰基化花青素在3 262～3 325 cm-1處-OH吸收峰減弱，2 974 cm-1處的C-H峰增強，1 650～1 870 cm-1處為C=O吸收峰，1 000～1 300 cm-1處為酚類分子的-OH彎曲振動吸收與C-O-C伸縮振動吸收等多種成分組成，并且兼具有苯環（1 420～1 600 cm-1）的骨架振動峰，峰明顯增強趨于穩定。

采用紫外-可見分光光度計對200～600 nm范圍內的非酰基化花青素和酰基化花青素進行了掃描。圖4b所示為酰基化對花青素吸光度的影響。對花青素進行結構分析結果表明，非酰基化花青素樣品在280 nm處有明顯的吸收，且在該波長處的吸收最為穩定，說明含有苯環，并且苯環上帶有酚羥基。361 nm處有吸收峰，300～400 nm處，主要是由B環上的酰基化基團引發的。酰基化花青素的吸收峰由280 nm前移到271 nm，說明花青素的結構發生了變化。240～280 nm（271 nm）主要是由A環上的苯甲酰基團引發的，227 nm的吸收峰主要是B環的六元不飽和環酮引起的，此時B環上不存在酰基。

2.3 酰基化對花青素穩定性影響

圖5a所示為非酰基化花青素和酰化花青素在不同溫度下避光水浴12 h后的熱穩定性。40、50和60 ℃下，酰基化花青素的保留率分別為89.1%、87.4%和84.2%，非酰基化花青素的保留率分別為84.5%、82.3%和79.0%，相同溫度下，酰基化花青素的保留率比非酰基化花青素的保留率均高約5.0%。這表明，在一定溫度作用下，酰基化花青素比非酰基化花青素相對穩定，桑椹花青素經酰基化處理后，可以在這些溫度下可以很好地保存。在一定溫度作用下，花青素及其糖苷被分解成小分子，如醛類、苯甲酸衍生物或同義花青素[17]，且隨著溫度的增加，降解越顯著，但酰基化花青素的熱穩定性優于非酰基化花青素。

與溫度對花青素穩定性的影響相比，光照顯著影響花青素的穩定性。圖5b所示，在20 ℃下暴露于450 W光照2、4、6、8、10和12 d后，非酰基化花青素保留率在10 d內線性急劇下降到77.3%，第12天保留率為68.0%。然而，酰基化花青素保留率始終高于非酰基化花青素，前6 d內，保留率下降緩慢，第6天保留率仍高達96.1%；后6 d保留率下降稍有增加，第12天保留率為74.3%。有研究表明酰基向花青素提供電子的潛在能力[36]，在增強了酰基化花青素的光照穩定性。

pH值對酰基化花青素穩定性的影響如圖5c所示。由圖可得，花青素對pH值敏感，花青素濃度隨pH值變化顯著。在低pH值酸性條件下，pH值為2時，非酰基化花青濃度變化幅度最大，接近酰基化花青素的2倍；pH值為3時，酰基化花青素的濃度幾乎不發生變化，而非酰基化花青濃度增加80%。在pH值為4～6時，酰基化花青素與非酰基化花青素的濃度基本無變化。在堿性pH值為7～9時，酰基化花青素與非酰基化花青素的濃度均發生變化，pH值為8時，非酰基化花青濃度增加約80%，為酰基化花青素的2倍。通過以上分析可得，酰基化花青素在不同pH值下更加穩定，尤其是在強酸性和強堿性環境中的穩定性大大提高。花青素的性能易受溶液pH值變化影響，這與其分子結構密切相關。在低pH值區（pH值＜3），花青素以高度穩定的黃色離子存在，呈鮮紅色。隨著pH值的升高，水解產物變成無色的甲醇假堿，經開環形成黃色的查爾酮，而酰基化花青素更穩定。多酰基化花青素的高穩定性是由于其與芳香羧酸之間的疏水作用形成的三明治狀分子內堆積，阻止了糖苷的水合作用和顏色的降解[25]。

2.4 酰基化對花青素抗氧化性影響

酰基化對花青素DPPH自由基清除能力的影響如圖6a所示，以VC作為陽性對照。研究發現，兩組DPPH自由基清除活性表現顯著差異，酰基化花青素DPPH自由基清除能力始終高于非酰基化花青素。隨著濃度的增加，非酰基化花青素DPPH自由基清除率線性增加，非酰基化花青素DPPH自由基清除50%時的濃度IC50值為0.5 mg/mL，當花青素濃度為0.8 mg/mL時，DPPH自由基清除率為71%。而酰基化花青素在濃度0.2～0.8 mg/mL時，DPPH自由基清除率范圍為88%～96%，始終穩定保持在較高水平。對酰基化花青素DPPH自由基清除率進行非線性擬合，酰基化花青素IC50值為0.01 mg/mL。IC50值越大，則DPPH自由基清除50%時，所需花青素的濃度越大，樣品的抗氧化活性越低。酰基化花青素IC50值顯著小于非酰基化花青素，因此DPPH自由基清除能力越強，表明酰基化提高了花青素的抗氧化性能。

花青素生物抗氧化性與其還原能力密切相關，在700 nm處吸光度值的大小表示花青素給電子的能力。酰基化對花青素總還原能力的影響如圖6b所示，以VC作為陽性對照。由圖可得，隨著濃度的增加，非酰基化花青素和酰基化花青素的總還原能力均增強，酰基化花青素的總還原能力較非酰基化的花青素有所提升。當質量濃度為0.1～0.4 mg/mL時，非酰基化花青素的吸光度值增加明顯，由0.45增大到了0.73，增加62%；當質量濃度為0.4～0.8 mg/mL時，非酰基化花青素的吸光度值基本保持約0.75，表明花青素的總還原能力趨于穩定。而酰基化花青素的吸光度值呈線性增加，當質量濃度為0.8 mg/mL時，酰基化花青素的吸光度值為0.99，這表明其總還原能力比非酰基化花青素提高30%。

花青素具有一定的金屬離子螯合能力，圖6c所示為酰基化對花青素Fe2+鰲合能力的影響。研究發現，隨著濃度的增加，非酰基化花青素和酰基化花青素的Fe2+鰲合能力均呈線性增強趨勢，酰基化花青素的Fe2+鰲合能力顯著高于非酰基化花青素。當質量濃度為0.1 mg/mL時，酰化花青素的金屬離子螯合能力已達到70%。當花青素質量濃度為0.8 mg/mL時，酰化花青素的金屬離子螯合能力高達到90%，而非酰化花青素僅為68%。結果表明，酰基化花青素的Fe2+鰲合能力大大提高。

本試驗研究采用MTT法測定非酰基化花青素和酰基化花青素對倉鼠卵巢上皮細胞活性的影響，如圖7所示。結果表明，非酰基化和酰基化花青素對腫瘤細胞活性均有抑制作用，且隨著花青素濃度逐漸增加，增殖抑制率增大。當花青素質量濃度范圍6～46μg/mL時，非酰基化花青素的細胞活性抑制率顯著高于酰基化花青素。而當花青素質量濃度范圍96～750μg/mL時，酰基化花青素的細胞活性抑制率逐漸超過非酰基化花青素，且隨著濃度的繼續增大，酰基化花青素對細胞增殖抑制作用越來越顯著，質量濃度為750μg/mL時，酰基化花青素腫瘤細胞活性抑制率高達81%，而非酰基化花青素約為50%。

研究表明，生物酶酰基化花青素可以在不影響生物活性和色度特性的前提下提高其穩定性[35]。酰基的類型、位置和數量是影響穩定性的主要因素，通過增加花青素的極性、分子大小以及改變空間結構來影響花青素的反應性。酰基化降低了花青素的極性，并產生空間位阻效應，降低花青素對親核攻擊的敏感性。由酰基引起的分子間輔色作用對花青素C2、C4位置的OH親核攻擊產生有效的物理阻礙[25]。此外，生物酶酰基化反應具有更強的化學選擇性和區域選擇性，不僅能提高黃酮類化合物在各種非水介質中的溶解度，而且還能增強其穩定性和抗氧化活性[37]。更親脂的衍生物有利于提高花青素的抗氧化能力，可以更有效地保護親脂底物免受氧化。

3 結 論

天然花青素可以作為一種優良的抗氧化劑，但是在其加工貯藏應用過程中存在著穩定性差，脂溶性低的問題，本文利用生物酶法酰基化修飾桑椹花青素，顯著改善其穩定性和抗氧化性，得到以下結論：

1）由單因素試驗可得，以轉化率為考察指標，確定反應優化條件為南極假絲酵母脂肪酶作為催化酶，吡啶作為反應溶劑，苯甲酸甲酯作為酰基供體，桑椹花青素酰基轉化率最高為13.5%，保留率最高為38.4%。經HPLC-MS正離子模式鑒定分析，花青素酰基化產物可能是單酰基花青素也可能是多酰基花青素。

2）酰基化修飾可以大大提高花青素的熱穩定性、光穩定性和酸堿穩定性。在40、50和60 ℃下可以更好地保存，光照6 d后，酰基化花青素的保留率仍高達96.1%，pH值分別為2、3、8環境中，酰基化花青素穩定性顯著提高。

3）酰基化可以顯著增加花青素體外抗氧化性，酰基化花青素DPPH自由基清除能力較強，總還原能力比非酰基化花青素提高30%，金屬離子螯合能力高達到90%，腫瘤細胞活性抑制率高達81%，有效抑制細胞增殖。

綜上，該研究為花青素在功能性食品、生物醫藥和植物源農藥、日用化妝品等生產領域中的穩定應用及性能改善提供參考的理論依據和技術支持。