臨床用途細胞凍存保護液探索實驗

姬廣超，王曉明，王玉琪，宋航飛

近些年，我們國家的細胞產業發展迅速。不論是干細胞技術還是免疫細胞技術，相關的科學研究都十分火熱，且有一部分機構的相關產品已經進入了臨床試驗階段。不同于其他藥品，細胞產品是具有代謝能力的活細胞，保存方法和保存時間受到了很大的限制，影響了其應用。

新鮮細胞產品保存時限較短，為了長期保存細胞產品，通常進行細胞凍存，保存在-80 ℃ 冰箱或是-196 ℃ 的液氮環境下。細胞凍存過程對細胞有傷害，所以需要細胞凍存保護液來減低細胞的損傷。實驗室常用的細胞凍存保護液配方是 10% 二甲基亞砜（DMSO）+ 90% 胎牛血清（FBS），通用性好，細胞保護效果好，受到了廣泛認可。但其配方中含有動物來源的 FBS，有無法消除的安全隱患。所以，用可臨床應用的成分替代 FBS 具有重要意義。本實驗采用可臨床應用的成分替代 FBS，探索一種可供臨床應用的細胞凍存保護液。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 細胞樣本由上海安庫生醫生物科技有限公司細胞庫提供。

1.1.2 儀器 HFsafe-1200LC 生物安全柜/HF90 二氧化碳培養箱為力康生物醫療科技控股有限公司產品；L535-1 低速離心機為湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司產品；Countstar IC-1000 細胞計數儀為上海睿鈺生物科技有限公司產品。

1.1.3 主要試劑 6% 羥乙基淀粉 130/0.4 氯化鈉注射液購自費森尤斯；二甲基亞砜購自美國 Sigma 公司；人血白蛋白購自上海萊士血液制品股份有限公司；胎牛血清購自達科為生物技術股份有限公司；0.9% 氯化鈉注射液購自安徽雙鶴藥業；葡萄糖購自碧云天生物；右旋糖酐購自上海泰坦科技股份有限公司；MSC FreezIS DMSO-Free 購自 Irvine Scientific 公司。

1.2 方法

本實驗采用外周血單個核細胞（PBMC）和臍帶間充質干細胞（UC-MSC）各 6 個樣本進行實驗。選取庫存細胞樣本，復蘇后培養 24～48 h 后，收獲計數。細胞定容至550～600 μl，取 100 μl 分別加入含 900 μl 不同細胞凍存保護液的 2 ml 凍存管中。放入程序降溫盒移至-80 ℃ 冰箱，過夜轉移至液氮罐保存。30 d 后，取出細胞，37 ℃ 水浴鍋快速融化。混勻細胞并使用細胞計數儀進行臺盼藍法計數。統計計數結果：活細胞復蘇率 = 凍存后活細胞數/凍存前活細胞數，使用統計軟件 SPSS 26.0 進行單因素方差分析。不同凍存保護液配方見表1。

表1 不同凍存保護液配方

2 結果

2.1 PBMC 組不同配方凍存保護液活細胞復蘇率

PBMC 組不同配方凍存保護液活細胞復蘇率（表2）以配方 B 的凍存保護效果最好，差異顯著（P＜ 0.05）。

表2 PBMC 組不同配方凍存保護液活細胞復蘇率

2.2 UC-MSC 組不同配方凍存保護液活細胞復蘇率

UC-MSC 組不同配方凍存保護液活細胞復蘇率（表3）以配方 C 的凍存保護效果最好，差異極顯著（P＜ 0.01）。

表3 UC-MSC 組不同配方凍存保護液活細胞復蘇率

2.3 不分組不同配方凍存保護液活細胞復蘇率

不分組不同配方凍存保護液活細胞復蘇率（表4）以配方 C 的凍存保護效果最好，差異極顯著（P＜ 0.01）。通過多重比較（表5），可見配方 B 的凍存保護效果雖然次于配方 C，但兩者差異不顯著。所以，配方 B 有望作為配方C 的替代方案，并有望成為一種可臨床應用的凍存保護液方案。

表4 不分組不同配方凍存保護液活細胞復蘇率

表5 不分組不同配方凍存保護液活細胞復蘇率多重比較

3 討論

細胞凍存保護液主要依靠其中的冷凍保護劑成分來實現在細胞凍存過程中保護細胞的作用。冷凍保護劑根據其是否穿透細胞膜通常分為兩大類型：滲透性冷凍保護劑和非滲透性冷凍保護劑。滲透性冷凍保護劑多為小分子中性物質，主要包括甘油、DMSO、丙二醇、乙二醇、乙酰胺、甲醇等。非滲透性保護劑多為大分子物質，主要包括海藻糖、聚乙二醇、羥乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖、白蛋白等[1]。

DMSO 是最常用的凍存保護劑和常用藥用輔料，在國家藥品監督管理局藥品審評中心常用藥用輔料數據庫可以查詢到其詳細信息，但沒有最大注射用量信息。美國 FDA官方網站，可以查詢到的造血祖細胞、臍帶血靜脈注射用懸液的處方信息里提到，“二甲基亞砜的最大耐受劑量尚未確定，但靜脈注射時一般不超過 1 g/(kg·d) 的劑量”。目前并沒有藥用注射級別的 DMSO 產品。

凍存液中加入 FBS，可補給細胞營養、增殖細胞因子、穩定培養液 pH 值及營造高濃度蛋白狀態，對保護細胞有重要意義[2]。FBS 為異種血清，且其成分不明，不能用于臨床。許多學者嘗試用其他成分替代 FBS。游小燕等[3]用蔗糖、乙二醇、DMEM 替代 FBS 去凍存豬胎兒成纖維細胞；趙滿倉等[4]用羥乙基淀粉、人血白蛋白和甘油替代 FBS 去凍存 DC 細胞，都取得了較好的效果。張麗娟等[5]采用其他臨床可用成分（人血白蛋白、復方電解質注射液）來代替臨床不可用成分（FBS 和細胞培養基），探索研究一種可供臨床應用的細胞凍存保護劑，但并沒有提供其凍存液與常用凍存液之間凍存效果的對比。

Park 等[6]通過實驗證明了人血白蛋白（HSA）、人血清（HS）或敲除血清替代物（KSR）可以替代 FBS 用于人脂肪間充質干細胞的冷凍保存。Niknejad 等[7]使用人羊水來替代 FBS 凍存人羊膜上皮細胞，結果顯示（含羊水的凍存保護液和含胎牛血清的凍存保護液）凍存細胞的存活率無顯著差異。Ray 等[8]研制了一種無血清無毒性的 10% PVP/0.9%NaCl/60 mmol/L 依克多因的凍存保護液，用來凍存人脂肪來源的干細胞，存活率可高達 81%。Martina 等[9]使用絲膠蛋白替代凍存保護液中的 FBS 和 DMSO，實驗結果顯示，在凍存人骨髓間充質干細胞時，絲膠蛋白可以替代凍存保護液中的 FBS，卻不能替代凍存保護液中的 DMSO。Yoshitake 等[10]使用超快速冷凍（superflash freezing，SFF）來實現細胞的無凍存保護劑的凍存方法，該方法已在小鼠成纖維細胞 3T3 細胞、小鼠成肌細胞 C2C12 細胞以及大鼠原代間充質干細胞等的凍存上獲得了驗證。該無凍存保護劑方法是否適合絕大多數細胞，還有待進一步驗證。

本研究中使用的凍存保護液，不考慮實驗室常用的配方C，配方 E 是采用的無 DMSO 的商品化凍存保護液，其他配方的成分中除 DMSO 外，皆有相應的臨床藥品提供。其中由于無法購買到右旋糖酐注射液，所以用氯化鈉注射液、葡萄糖、右旋糖酐按照右旋糖酐注射液（右旋糖酐氯化鈉注射液、右旋糖酐葡萄糖注射液）的比例配制替代臨床藥品成分來驗證凍存液配方。本研究中，比較不同凍存保護液配方的凍存保護效果時，細胞凍存時間僅 30 天，檢測指標也僅限于凍存細胞的活細胞復蘇率，沒有對復蘇后細胞的增殖能力以及腫瘤殺傷活性等做進一步檢測，存在一定的局限性。

從實驗結果可以看出，凍存保護液的配方 B 和配方 C具有良好的細胞凍存保護效果。不分組統計分析時，配方 C的活細胞復蘇率略高于配方 B，但兩者差異不顯著。研究的結果初步提示：在 DMSO 的臨床風險可接受的情況下，凍存保護液配方 B 有望成為可供臨床應用的凍存保護液，提高細胞產品的可用性和廣泛性，能使更多的目標人群受益。

與實驗室常用的凍存保護液成分及其配方相比，選用已獲得國藥準字的注射級藥品作為凍存保護液成分（如配方B），在不顯著降低凍存保護液對細胞保護效果的同時，還能夠進一步提高凍存保護液自身在臨床應用上的安全性；其產品成為某些種類的細胞治療產品優選的凍存保護液，甚至有可能滿足經深低溫冷凍和保藏的細胞治療產品在復蘇后直接輸入人體的要求，但其是否能最終成為可以直接輸入人體的臨床級細胞凍存保護液，尚有待進一步的相關研究和臨床試驗的證明。