Hp 陽性胃癌組織miR-1290、miR-490-3p表達變化及其臨床意義

楊寧波，寇耀，賈映東

遂寧市中心醫院，四川遂寧629000

2018 年全球胃癌新發病例約103.4 萬例，死亡約78.3 萬例，其發病率和死亡率分別居所有惡性腫瘤的第5、3 位［1］。胃癌的發生是遺傳因素、環境因素、幽門螺旋桿菌（Hp）感染等諸多因素長期綜合作用的結果，其中Hp 感染被世界衛生組織明確列為胃癌的Ⅰ類致癌因素［2］。Hp 感染在胃炎、胃潰瘍、胃癌前病變和胃癌等胃部疾病的演變過程中均具有重要作用［3］。因此，探究Hp 陽性胃癌發生、發展的分子機制并從中尋找腫瘤標志物，對Hp 陽性胃癌的診斷、治療和預后判斷具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一類長度為20～24 nt 的小RNA分子，在機體內廣泛分布，通過與靶mRNA 特異性結合而調控基因的表達，從而參與機體生長、發育等生物學過程［4］。在胃癌的發生、發展過程中存在眾多miRNA 異常表達，這些異常表達的miRNA 可能參與胃癌細胞的增殖、遷移和耐藥性等［5］。微小RNA-1290（miR-1290）在胰腺癌和食管鱗癌等消化系統腫瘤中表達上調，可參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等多種生物學過程［6-7］。微小RNA-490-3p（miR-490-3p）在多種腫瘤中表達下調，能夠抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等生物學過程［8］。但目前關于Hp 陽性胃癌組織miR-1290、miR-490-3p 表達的研究較少。為此，我們進行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014 年1 月—2015 年6 月遂寧市中心醫院收治的胃癌患者92 例。納入標準：①經術后組織病理學檢查明確胃癌診斷；②初診；③接受外科手術治療；④臨床相關資料和術后隨訪資料完整。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤者；②合并自身免疫性疾病或全身急慢性感染者；③心、肝、腎等重要臟器功能障礙者。根據Warthin-Starry染色結果，將胃癌患者分為Hp 陽性61 例、Hp 陰性31 例。Hp 陽性胃癌患者中，男39 例、女22 例，年齡34～65（49.46 ± 6.08）歲；腫瘤直徑：≤3 cm 31 例，＞3 cm 30例；病理類型：腺癌48例，印戒細胞癌10例，黏液癌3 例；TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期41 例，Ⅲ、Ⅳ期20例；組織分化程度：低分化24 例，高中分化37 例；浸潤深度：黏膜層25例，黏膜下層36例；有淋巴結轉移30 例，無淋巴結轉移31 例；有遠處轉移27 例，無遠處轉移34 例。Hp 陰性胃癌患者中，男22 例、女9例，年齡32～67（49.69±5.78）歲；腫瘤直徑：≤3 cm 16 例，＞3 cm 15 例；病理類型：腺癌25 例，印戒細胞癌5例，黏液癌1例；TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期21例，Ⅲ、Ⅳ期10 例；組織分化程度：低分化14 例，高中分化17例；浸潤深度：黏膜層13 例，黏膜下層18 例；有淋巴結轉移16 例，無淋巴結轉移15 例；有遠處轉移14例，無遠處轉移17 例。Hp 陽性與陰性胃癌患者臨床資料具有可比性。本研究經遂寧市中心醫院醫學倫理委員會審核，患者或其家屬知情同意。

1.2 miR-1290、miR-490-3p 表達檢測 采用RTqPCR 法。取手術切除的胃癌組織及其配對的癌旁組織（距腫瘤組織邊緣＞5 cm，并經組織病理學檢查證實為正常胃組織），剪碎后置于液氮預冷的研缽，在液氮下用研杵研磨成粉末，然后轉移至1.5 mL 離心管中。采用TRIzol 法提取和分離組織總RNA。根據cDNA合成試劑盒操作說明將總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄反應條件：37 ℃20 min，80 ℃1 min。按實時熒光定量PCR 試劑盒操作說明行PCR 擴增。所有引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。 引物序列：miR-1290 上游引物5"-GCAAAGTGTGTTCTTAAGCG-3"、下游引物5"-TGC?GATGCTAGCGTGACC-3"，miR-490-3p 上游引物5"-AAGGGTAGATTTAGGCTGTA-3"、下 游 引 物 5"-AGTTGAGAAAAAGTTATGCAC-3"，內參U6 上游引物5"-CCCTATTTTTGACGCGTTATGTGA-3"、下游引物3"-GTGAAAATTACAGGGTCATTTGTG-5"。按PCR試劑盒說明配制反應體系。PCR 反應條件：94 ℃5 min，94 ℃30 s、60 ℃50 s、70 ℃10 s 共40 個循環。檢測儀器為CFX 384Touch多通道熒光定量PCR 儀，所有檢測由專人負責并嚴格按照試劑盒說明書和儀器操作規程進行操作。以U6 為內參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

1.3 隨訪 采用門診復查形式定期隨訪，隨訪截至2020 年6 月30 日。以患者死亡或至隨訪截至日期為終點，統計患者5年總生存率。

1.4 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。計量資料以±s表示，兩樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson 相關分析法。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比較采用Log-rank 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織與癌旁正常組織miR-1290、miR-490-3p表達比較 見表1。

表1 胃癌組織與癌旁正常組織miR-1290、miR-490-3p相對表達量比較（ ± s）

表1 胃癌組織與癌旁正常組織miR-1290、miR-490-3p相對表達量比較（ ± s）

注：與癌旁正常組織Hp同狀態比較，*P＜0.05；與同組織類型Hp陰性比較，#P＜0.05。

組織類型癌旁正常組織Hp陰性Hp陽性胃癌組織Hp陰性Hp陽性n miR-1290 miR-490-3p 31 61 10.07±1.85 9.84±1.79 34.59±8.07 33.74±7.95 15.72±3.28*10.96±2.08*#31 61 20.54±4.38*29.58±5.01*#

2.2 胃癌組織miR-1290 表達與miR-490-3p 表達的關系 無論是Hp 陽性胃癌組織還是Hp 陰性胃癌組織，miR-1290 表達與miR-490-3p 表達均無明顯相關性（r分別為-0.178、-0.079，P均＞0.05）。

2.3 Hp 陽性胃癌組織miR-1290、miR-490-3p 表達與患者臨床病理特征的關系 見表2。

2.4 Hp 陽性胃癌組織miR-1290、miR-490-3p 表達與患者預后的關系 分別以Hp 陽性胃癌組織miR-1290、miR-490-3p 相對表達量的中位數（28.71、10.12）為臨界值，將患者分為miR-1290 低表達者30 例與miR-1290 高表達者31 例、miR-490-3p 低表達者30 例與miR-490-3p 高表達者31 例。結果發現，miR-1290 低表達者5 年總生存率為56.7%（17/30），miR-1290 高表達者為22.6%（7/31），miR-1290 低表達者5 年總生存率明顯高于miR-1290 高表達者（χ2=5.057，P＜0.05）；miR-490-3p 低表達者5年總生存率為20.0%（6/30），miR-490-3p 高表達者為58.1%（18/31），miR-490-3p 低表達者5 年總生存率明顯低于miR-490-3p 高表達者（χ2=6.658，P＜0.05）。見圖1、2。

3 討論

據報道，我國每年胃癌新發病例約42 萬例，死亡約30 萬例，已成為全球胃癌高負擔國家之一［9］。由于胃癌早期癥狀隱匿，多數患者就診時已屬中晚期，即使經積極綜合治療，遠期預后仍然不佳，5 年生存率僅27%。目前，Hp 感染是胃癌最明確、最重要的致病因素，但其導致胃癌發病的分子機制尚不完全清楚。因此，深入研究Hp感染所致胃癌的分子機制，對探索胃癌早期診斷的分子標志物和治療靶點具有重要意義。

miRNA 是一類小分子單鏈非編碼RNA，能在轉錄后水平調控靶基因的表達。miRNA 與mRNA 結合形成雙鏈RNA 并被Dicer 蛋白識別，Dicer 蛋白具有核糖核酸酶活性，能夠催化雙鏈RNA 斷裂而造成mRNA 降解，從而下調基因的表達。有研究報道，腫瘤、炎癥性或免疫性疾病存在多種miRNA 異常表達現象［10］。JIANG 等［11］報道，Hp 感染會引起胃黏膜組織中一系列miRNA 的異常表達，并且這部分異常表達的miRNA 能夠影響胃黏膜組織中促癌基因或抑癌基因的異常表達，從而導致胃癌的發生、發展。miR-1290是近年發現的具有腫瘤促進作用的miRNA，其在宮頸癌、口腔鱗癌等惡性腫瘤組織中表達升高，體外研究證實miR-1290 過表達能夠促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移［12］。因此，miR-1290 有可能成為胃癌診斷的潛在分子標志物。在腫瘤中還存在一些具有腫瘤抑制作用的miRNA，如miR-26a，其能抑制c-Myc等癌基因表達，抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等生物學行為［13］。近年有學者報道，miR-490-3p作為一種新的抑癌基因，能夠抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等生物學行為，并且還能誘導腫瘤細胞凋亡［14］。但目前關于Hp 陽性胃癌組織miR-1290、miR-490-3p表達的研究報道較少。

本研究結果發現，Hp 陽性胃癌組織miR-1290表達上調，并且有遠處轉移、淋巴結轉移以及TNM分期Ⅲ、Ⅳ期患者miR-1290 表達明顯升高，提示miR-1290 表達上調能夠促進Hp 陽性胃癌的發生、發展。細胞周期蛋白G2具有腫瘤抑制作用，其通過阻滯細胞周期進展而抑制腫瘤細胞增殖。有研究報道，miR-1290 通過抑制細胞周期蛋白G2 表達，導致腫瘤惡性進展［15］。因此，Hp陽性胃癌組織miR-1290表達上調可能會下調細胞周期蛋白G2轉錄水平，導致其表達下調，最終解除細胞周期蛋白G2 對Hp 陽性胃癌細胞的增殖抑制作用，從而促進腫瘤細胞增殖。有研究發現，miR-1290 可通過抑制堿性螺旋—環—螺旋轉錄因子表達來下調上皮標志物表達，導致腫瘤惡性程度增加［16］。提示miR-1290 表達失調可能通過引起上皮間質轉化而促進腫瘤侵襲和轉移。目前，miR-1290 在Hp 陽性胃癌中表達上調的分子機制以及Hp 感染在miR-1290 表達上調中的作用尚不清楚，仍需進一步研究。

表2 Hp陽性胃癌組織miR-1290、miR-490-3p表達與患者臨床病理特征的的關系

圖1 Hp陽性胃癌患者不同miR-1290表達者的生存曲線

圖2 Hp陽性胃癌患者不同miR-490-3p表達者的生存曲線

本研究結果發現，Hp 陽性胃癌組織miR-490-3p表達下調，提示其表達下調可能與胃癌的發生、發展有關。但miR-490-3p 表達下調導致胃癌發生、發展的分子機制尚不清楚，可能與長鏈非編碼RNA（如lncRNA RP11-480112.5）表達調控的抑制作用有關［17］。本研究還發現，有遠處轉移、淋巴結轉移以及TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期Hp 陽性胃癌患者miR-490-3p 表達明顯下降，表明miR-490-3p 在Hp 陽性胃癌侵襲和轉移的分子調節過程中發揮重要作用。有研究報道，促癌基因高遷移率族蛋白A2是miR-490-3p的靶基因，miR-490-3p 能夠下調高遷移率族蛋白A2 表達，抑制細胞上皮間質轉化，從而延緩腫瘤惡性進展［18］。

本研究生存分析發現，miR-1290 低表達者5 年總生存率明顯高于miR-1290 高表達者，miR-490-3p低表達者5年總生存率明顯低于miR-490-3p高表達者，提示miR-1290 高表達、miR-490-3p 低表達與Hp陽性胃癌患者預后不良密切相關，二者有可能作為Hp陽性胃癌患者預后評估的分子標志物。

綜上所述，Hp 陽性胃癌組織miR-1290 表達上調、miR-490-3p表達下調，其表達變化與腫瘤淋巴結轉移、遠處轉移、TNM 分期和患者預后有關。miR-1290、miR-490-3p有可能成為Hp陽性胃癌診斷和預后評估的分子標志物。