外周血ERβ 基因AluI 位點多態性與妊娠期糖尿病易感性的關系

鐘萍，莫蕾，全麗虹

桂林醫學院第二附屬醫院，廣西桂林541199

妊娠期糖尿病（GDM）是妊娠期特有的代謝性疾病，可增加妊娠期高血壓、子癇前期、新生兒窒息等母嬰并發癥的發生風險［1］。一般認為，GDM 的發病機制與炎癥反應、免疫反應、代謝紊亂、胰島素抵抗等有關。近年研究發現，一些重要基因的突變可能亦與GDM 的發生有關［2］。雌激素受體（ER）是一類由配體激活的核轉錄因子。在妊娠期ER 主要發揮抗孕激素、調節脂質代謝、促進葡萄糖攝取等作用，故ER 表達異常可能與GDM 的發生有關［3］。ER有ERα、ERβ 兩種亞型，其中ERα 基因多態性已被證實與GDM 的發生有關［4］，而ERβ 基因多態性與GDM 的易感性是否相關尚不明確。為此，本研究觀察了外周血ERβ 基因AluI 位點多態性與GDM 易感性的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018 年1 月—2020 年3 月桂林醫學院第二附屬醫院接診的GDM 孕婦500 例（觀察組）。所有患者符合《妊娠合并糖尿病診治指南（2014）》中的診斷標準［5］。納入標準：①符合GDM診斷標準；②初診；③單活胎妊娠，孕周＞24 周；④年齡20～40 歲，漢族。排除標準：①經輔助生殖技術受孕者；②孕前3個月內有激素暴露史者；③妊娠期吸煙或酗酒者；④孕前合并糖尿病、高血壓、心臟病、高脂血癥等疾病者；⑤合并心、肝、肺、腎等重要臟器嚴重功能不全者；⑥合并血液系統或免疫系統疾病者。另選同期桂林醫學院第二附屬醫院接診的，與觀察組年齡匹配的、糖耐量正常的單活胎妊娠孕婦500 例（對照組），均為漢族，入組前經產前檢查排除妊娠期合并癥或并發癥。本研究經桂林醫學院第二附屬醫院醫學倫理委員會批準，所有研究對象或其家屬知情同意。

1.2 外周血ERβ 基因AluI 位點多態性檢測 所有研究對象妊娠24～28周采集空腹肘靜脈血3 mL，置于肝素鈉抗凝管中，然后加入紅細胞裂解液輕輕吹打混勻，冰浴裂解30 min，4 ℃下2 000 r/min 離心3 min、離心半徑8 cm，棄上清液，加入5%Chelez-100 200 μL 充分混勻，56 ℃孵育20 min，室溫震蕩10 s，4 ℃下3 000 r/min 離心2 min、離心半徑10 cm，取上清液-20 ℃保存。取上清液60 μL，采用AU1001 全自動核酸提取儀及其配套試劑提取DNA，以Tris-HCl 為空白對照，采用UV7500 雙光束紫外可見分光光度計鑒定提取的DNA 純度和濃度，選 取OD260/OD280為1.6～1.8、濃 度＞50 ng/μL 的DNA 樣本進行后續實驗。通過GenBank 數據庫查找ERβ 基因，所有引物由蘇州金唯智生物科技有限公司設計合成。ERβ 基因AluI 位點上游引物5′-GACCTGCTGCTGGAGATGCT-3′下游引物5′-AATGAGCCACAGCA-3′；GAPDH 上游引物5′-TG?TACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物5′-CTG?GAAGGTGGACAGCGAGG-3′。以提取的DNA 為模板進行PCR 擴增。PCR 反應體系共20 μL：DNA 模板2 μL，上下游引物各0.6 μL，10×PCR Buffer 2 μL，dNTPs 1.6 μL，Taq 酶1 μL，ddH2O 12.2 μL；反應條件：94 ℃5 min，94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃30 s共35個循環，最后72 ℃5 min。取PCR 擴增產物10 μL，加入pFUW80 1 μg、B.M.10×H緩沖液2 μL、XhoI 1 μL、SpeI 1 μL，37 ℃消化3 h，65 ℃滅活10 min，2%瓊脂糖凝膠電泳分離30 min，溴化乙錠染色，FR-250 電泳儀掃描成像。采用iMLDR 法SNaPshot 基因分型技術分析外周血ERβ基因AluI位點多態性。

1.3 血生化指標檢測 所有研究對象妊娠24～28周采集空腹肘靜脈血10 mL，4 ℃下3 000 r/min離心15 min、離心半徑10 cm，取上層血清，-80 ℃保存。采用雅培i2000 全自動化學發光免疫分析儀及其配套試劑檢測空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS），采用穩態模型法計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR），HOMA-IR=FPG×FINS/22.5；采用羅氏Modular 全自動生化分析儀檢測TC、TG。

1.4 資料收集與分析 收集所有研究對象年齡，孕前BMI、收縮壓、舒張壓和糖尿病家族史，妊娠24～28 周血生化指標（FPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG），妊娠早期（末次月經至妊娠13周）和妊娠中期（妊娠14～28 周）體質量增加以及外周血ERβ 基因AluI位點多態性等臨床相關資料，采用二元Logistic 回歸模型分析影響GDM發生的危險因素。

1.5 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Student-t檢驗；兩樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗。危險因素分析采用二元Logistic回歸模型。群體代表性分析采用Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血ERβ 基因AluI 位點基因型和等位基因分布比較 兩組外周血ERβ 基因AluI 位點基因型和等位基因分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P均＞0.05），具有群體代表性。兩組外周血ERβ 基因AluI 位點基因型和等位基因分布比較差異均有統計學意義（χ2分別為35.425、36.153，P均＜0.05），見表1。攜帶ERβ 基因AluI 位點AA、Aa基因型孕婦GDM 的發生風險明顯高于攜帶aa 基因型孕婦（OR分別為1.726、1.439，95%CI分別為1.235～8.263、1.056～4.267），攜帶ERβ 基因AluI位點A 等位基因孕婦GDM 的發生風險明顯高于攜帶a 等位基因孕婦（OR=1.821，95%CI：1.403～12.051）。

表1 兩組外周血ERβ基因AluI位點基因型和等位基因分布

2.2 GDM 患者外周血ERβ基因AluI位點不同基因型者血生化指標比較 見表2。

表2 GDM患者外周血ERβ基因AluI位點不同基因型者血生化指標比較（±s）

表2 GDM患者外周血ERβ基因AluI位點不同基因型者血生化指標比較（±s）

注：與aa基因型者比較，*P＜0.05。

研究對象AA基因型者Aa基因型者aa基因型者TG（mmol/L）1.91±0.34 1.92±0.31 1.90±0.35 n 95 221 184 FPG（mmol/L）5.78±2.65*5.73±2.61*4.13±1.43 FINS（mmol/L）7.95±2.89*7.91±2.80*6.67±1.74 HOMA-IR 1.26±0.27*1.22±0.25*0.92±0.13 TC（mmol/L）4.49±0.51*4.42±0.47*3.65±0.36

2.3 影響GDM 發生的危險因素分析 單因素分析發現，觀察組孕前BMI、孕前收縮壓、糖尿病家族史、FPG、FINS、HOMA-IR、TC、妊娠早期體質量增加、妊娠中期體質量增加均高于對照組（P均＜0.05），而兩組年齡、孕前舒張壓、TG 比較差異均無統計學意義（P均＞0.05）。見表3。

表3 兩組臨床相關資料比較（±s）

表3 兩組臨床相關資料比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別觀察組對照組n 500 500年齡（歲）29.35±5.12 28.91±5.42孕前BMI（kg/m2）24.35±4.15*21.05±3.02孕前收縮壓（mmHg）123.15±6.09*120.43±5.03孕前舒張壓（mmHg）65.32±4.12 64.83±4.08糖尿病家族史［例（%）］62（12.40）*26（ 5.20）FPG（mmol/L）5.15±2.35*3.62±0.51組別n觀察組對照組FINS（mmol/L）7.46±2.61*7.52±1.06 TC（mmol/L）4.15±0.65*3.63±0.31 HOMA-IR 1.12±0.24*0.82±0.15 mmol/L（mmol/L）1.91±0.35 1.88±0.33 500 500體質量增加（kg）妊娠早期4.91±1.02*3.69±0.79妊娠中期10.53±3.95*7.35±2.81

以是否患GDM 為因變量（0=否，1=是），以孕前BMI（連續變量）、孕前收縮壓（連續變量）、糖尿病家族史（1=無，2=有）、FPG（連續變量）、FINS（連續變量）、HOMA-IR（連續變量）、TC（連續變量）、妊娠早期體質量增加（連續變量）、妊娠中期體質量增加（連續變量）、ERβ 基因AluI 位點多態性（1=AA 基因型，2=Aa 基因型，3=aa 基因型）為自變量，納入二元Logistic 回歸模型。結果發現，FPG、糖尿病家族史、ERβ 基因AluI 位點多態性是影響GDM 發生的危險因素（P均＜0.05）。見表4。

表4 影響GDM發生的二元Logistic回歸分析結果

3 討論

GDM 是妊娠期常見的并發癥之一，可增加妊娠期高血壓、子癇前期、新生兒窒息等母嬰并發癥的發生風險［1］，嚴重威脅圍生期母嬰安全。近年來，隨著我國二孩政策全面放開，高齡孕婦不斷增加，GDM的患病率亦不斷上升。GDM 的發病機制非常復雜，胰島功能減退、胰島素抵抗可能是其主要發病機制，年齡、肥胖、孕早期FPG 偏高、糖尿病家族史等可能是其發病的主要危險因素［6-7］。近年研究發現，遺傳因素在GDM的病因學中可能具有重要作用。CHEN等［8］研究指出，有糖尿病家族史者GDM 的發病風險更高。CUI 等［9］研究認為，個體遺傳變異與GDM 的發病風險密切相關。

雌激素是促進女性第二性征發育、性器官成熟的物質，主要由卵巢和胎盤（妊娠時）分泌，其受體廣泛分布于子宮、乳房、盆腔等。雌激素具有多種生理作用，包括促進和維持女性第二性征，對內分泌、心血管、代謝系統以及骨骼生長和成熟等亦具有一定作用。生理濃度的雌激素可通過上調胰島素受體表達，增加脂肪、肌肉組織等靶器官對胰島素的敏感度，從而抑制胰島素抵抗。妊娠期間過高水平的雌激素可對抗孕激素，從而影響胰島素受體表達，導致靶器官對葡萄糖攝取和利用降低，繼而出現GDM［10］。ERβ 是雌激素發揮生物學效應的主要介質之一，具有促進胰島素信號轉導、提高糖脂代謝相關酶活性、促進葡萄糖轉運蛋白表達等生理作用。近年研究發現，ERβ 能夠抑制胰島素抵抗，其功能異常與糖尿病、胰島素抵抗密切相關［11］。ERβ 基因定位于染色體14q22-24，由于受等位基因多態性的影響，其表達和生物學功能可能發生改變，從而引起2型糖尿病、骨質疏松癥等疾病的發生［12-13］。AluI是ERβ 常見的多態性位點，位于ERβ 基因8 號外顯子3。ERβ 基因AluI 位點突變可改變mRNA 穩定性和蛋白含量，導致ERβ 合成減少［13］。ZHU 等［14］報道，ERβ基因AluI位點A等位基因與女性絕經后骨密度降低、骨質疏松癥的發病有關；CAI 等［15］指出，ERβ基因AluI 位點A 等位基因與男性不育有關，AluI 位點GA、GG 基因型可能是精子發生功能障礙和精子質量惡化的危險因素。但ERβ 基因AluI 位點多態性是否與GDM 的易感性有關尚不清楚，目前相關報道較少。

本研究結果顯示，觀察組外周血ERβ 基因AluI位點AA、Aa 基因型以及A 等位基因分布均明顯高于對照組，表明A 等位基因可能與GDM 的易感性有關；進一步研究發現，攜帶AA、Aa 基因型孕婦罹患GDM 的風險明顯高于攜帶aa基因型孕婦，并且攜帶A 等位基因孕婦罹患GDM 的風險明顯高于攜帶a等位基因孕婦，提示GDM 發病可能具有遺傳背景，攜帶ERβ 基因AluI 位點A 等位基因可能是GDM 發病的重要危險因素。HERRERA-LOPEZ 等［12］研究認為，ER基因rs1256031位點多態性與墨西哥人T2DM的發病風險增加有關。XIANG 等［13］研究報道，ERβ基因多態性與中國漢族婦女雌激素缺乏介導的骨質疏松癥易感性增加有關。孫樹凱等［16］研究發現，GDM 發病與ERβ 基因AluI 酶切位點a 等位基因有關，攜帶a 等位基因孕婦GDM 的發病風險是攜帶A等位基因的1.559 倍，但本研究結論與其不同，其原因可能與地域、種族、樣本量等差異有關。因此，外周血ERβ 基因AluI 位點多態性與GDM 易感性的關系尚需多中心、大樣本量研究加以驗證。

糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗是GDM 的重要病理表現，兩者相互作用，形成惡性循環，從而加速胰島功能衰退。本研究結果發現，觀察組FPG、FINS、HOMA-IR、TC 均明顯高于對照組，說明GDM 孕婦已出現明顯的糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗。李丹丹等［17］研究報道，遺傳變異可能與胰島β 細胞功能障礙和胰島素抵抗有關。糖尿病前期人群KCNJ11 基因多態性可能影響其糖脂代謝［18］。提示某些基因多態性可能與糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗有關。本研究結果顯示，GDM 孕婦外周血ERβ基因AluI位點AA、Aa基因型者FPG、FINS、HOMA-IR、TC均高于aa基因型者，說明ERβ 基因AluI 位點多態性與GDM孕婦糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗有關，攜帶ERβ 基因AluI位點A等位基因孕婦糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗的發生風險更高。單因素分析發現，觀察組孕前BMI、孕前收縮壓、糖尿病家族史、FPG、FINS、HOMA-IR、TC、妊娠早期體質量增加、妊娠中期體質量增加均高于對照組，而兩組年齡、孕前舒張壓、TG

比較差異均無統計學意義；二元Logistic 回歸分析發現，FPG、糖尿病家族史、ERβ 基因AluI 位點多態性是影響GDM 發生的危險因素。進一步證實，外周血ERβ基因AluI位點多態性與GDM的易感性有關。綜上所述，外周血ERβ 基因AluI 位點多態性與GDM 的易感性密切相關，攜帶A 等位基因孕婦可能是GDM 易感的高危人群，并且與GDM 糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗有一定關系。