海南東部海水養殖區抗生素殘留的生態風險評估

曾若菡，齊 釗，張騰云，龔 瑩，張欽洲，王海花，刁曉平

（1.海南大學 生態與環境學院，海口 570228; 2.海南大學 南海海洋資源利用國家重點實驗室，海口 570228;3.海南師范大學 生命科學學院，海口 571158）

抗生素種類繁雜，現已達到幾千種，按照其化學結構主要分為β?內酰胺類、四環素類、喹諾酮類、大環內酯類、磺胺類、氨基糖苷類和氯霉素等，并且在多種環境介質中廣泛存在。水體中抗生素污染的來源主要有醫用、養殖業及制藥工業廢水排放。抗生素被使用后并不會被生物體完全吸收。殘留抗生素以多種形式經各種途徑排入水體等環境中，造成環境污染。國內的其他水環境（如地表徑流、地下水、海洋等）中都能檢測到抗生素的殘留。不同水域間的抗生素殘留量差別很大，殘留量最高的是養殖廢水。磺胺類、喹諾酮類、四環素類及氯霉素類等4 類抗生素由于具有較好的防治疾病和促生長等作用而被廣泛使用于水產養殖等行業，以達到治療、預防動物傳染性疾病和促進動物生長的目的[1?3]。水產養殖廢水的排放是水環境中抗生素污染的重要的人為來源。陵水新村、黎安港和萬寧小海海域是海南省重點海水養殖集中區，具有重要的生態及經濟價值[4]。新村港位于海南省陵水縣新村鎮的東南部，港內南北長4 km，東西寬6 km，面積24 km2，擁有上千家魚排，養殖著金鼓鰻魚、珍珠龍膽等魚類。萬寧小海現面積約43 km2，周長約43 km，小海物產豐富,著名的和樂蟹、港北對蝦和后安鯔魚均產于此。調查區域主要為淺海養殖中的網箱養殖。網箱的主要結構是框架和網衣，框架起到支撐固定網衣的作用，網箱面積可達到數十平方米，深度約為2～4 m。網衣上常附著水藻、微生物等多種物質。浮動式網箱能隨著水位的變化而上下浮動，在養殖中使用廣泛，常用于養殖魚類、螃蟹[5]。有研究表明，海南省每年每平方米的抗生素排放量處于我國相對較高水平[6]，但重要水產養殖區域養殖水體中抗生素的分布特征鮮見系統報道。為此，本研究采集海南島東部陵水新村、黎安港和萬寧小海，海域養殖區的海水樣品，通過LC-MS/MS 技術對樣品中4 類（磺胺類、喹諾酮類、四環素類及氯霉素類）40 種抗生素進行定量分析，以揭示養殖區海水中抗生素殘留的分布情況并進行生態風險評估，同時為養殖區生態水質監測和環境保護提供科學支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集本研究于2018 年8 月采集陵水新村、黎安港和萬寧小海養殖區海域表層海水樣本，共采集樣品15 個，采樣點分布見圖1。同一采樣點以棕色玻璃瓶采集1 L 水樣。水樣采集時取同一截面水平面0.5 cm 以下左中右3 個點的混合樣，每個樣點采集3 個重復。水樣置于4 ℃冰盒中避光冷藏保存，并于48 h 內進行前處理。采樣時詳細記錄監測點位的水溫、pH 值、溶解氧和鹽度等。

圖1 采樣點分布情況Fig.1 Sample site

1.2 抗生素檢測本研究對4 類（磺胺類、喹諾酮類、四環素類、氯霉素類）40 種抗生素進行檢測，檢測方法參照文獻[7]。

1.2.1 抗生素提取取1 L 已過濾水樣，用鹽酸-水溶液（V鹽酸∶V水=1∶1）調節pH 至2.5。依次用20 mL甲醇、6 mL 超純水、6 mL 鹽酸（pH2.5）對HLB 柱進行活化。用已活化HLB 柱對水樣進行富集，流速控制在5 mL·min?1左右。富集完成后用氮氣輕柔吹干富集小柱，將氮吹干燥后的小柱用12 mL 甲醇進行洗脫，收集洗脫液。洗脫液氮吹濃縮至近干。用流動相95%A（0.1%甲酸?1 g·L?1甲酸銨水溶液）和5%B（V甲醇∶V乙腈=1∶1）定容至1 mL，過0.22 μm 尼龍濾膜，待測。

1.2.2 抗生素檢測進樣量10 mL，柱溫40 ℃，流速0.30 mL·min?1。流動相A：0.1%甲酸?1 g·L?1甲酸銨水溶液；流動相B：V甲醇∶V乙腈=1∶1。梯度洗脫程序：起始5%B 3 min，然后在18 min 內從5%B 線性變化至88%B。質譜離子源：ESI+/ESI?切換，MRM 數據采集模式。待檢抗生素中氯霉素類抗生素采用負離子模式，其余抗生素采用正離子模式。

1.3 生態風險評估為研究抗生素在采樣區水體中抗生素對水生生物的生態風險，采用風險熵值（RQs）來評估。風險熵值法（RQs）來自歐盟的技術指導文件(European commission technical guidance document,TGD)，藥品在環境中的生態風險可以根據風險熵值(RQs)大小來評估，此方法被廣泛應用于分析廢水和地表水中常檢測到的藥物環境風險。RQs 通過污染物的環境實測濃度與預測無效應濃度的比值獲得，公式如下：

式中：MEC 為抗生素的實測質量濃度，ng·L?1；PNEC 為預測無效應濃度，即不會對生態環境產生不良影響的最大質量濃度，ng·L?1。

有研究[8?11]表明，多種抗生素存在于水體時，產生的毒性效應會加強。因此，用聯合風險熵值法（RQsum）來代表多種抗生素對水生生態系統的生態風險，計算公式：

由于不同種類抗生素對不同物種的毒性不同，因此，選用最敏感物種的PENC 作為評估值，6 種檢出的抗生素中丹諾沙星未能找出參考的PENC 值，其余如表1 所示。

表1 抗生素對應最敏感物種的毒理數據Tab.1 Toxicological data of antibiotics for the most sensitive species

2 結果與分析

2.1 不同采樣點海水中抗生素的檢出種類本研究對萬寧和陵水養殖區海水中4 類40 種抗生素進行檢測，研究區域共有6 種抗生素被檢出，喹諾酮類抗生素2 種、四環素類抗生素3 種、氯霉素類抗生素1 種，磺胺類抗生素未檢出（圖2）。對抗生素組成進行分析時發現，各采樣點抗生素組成結構存在差異，其中四環素類的強力霉素（DOX）、四環素（TC）、土霉素（OTC）在所有樣點中皆被檢出，氯霉素類的甲砜霉素（THI）除采樣點1 外，其余采樣點皆有檢出，喹諾酮類的環丙沙星（CIP）在采樣點3、7 被檢出，丹諾沙星（DAN）在采樣點4、11、15 被檢出。

圖2 采樣區海水中抗生素檢測種類的數量Fig.2 The number of antibiotic species detected in seawater sampled

2.2 不同采樣點抗生素的殘留濃度及分布特征對不同采樣點中抗生素殘留濃度進行統計分析（圖3），結果發現各海水樣品中總的抗生素殘留濃度為10.28～156.63 ng·L?1；其中采樣點10（新村漁港）抗生素殘留量最高（156.63 ng·L?1），其次是采樣點9 新村港（51.64 ng·L?1），采樣點11（黎安港）殘留量在已經檢出樣點中最低（10.28 ng·L?1；）。大多數樣點抗生素殘留量均小于20 ng·L?1。

圖3 不同采樣點海水中抗生素的總濃度情況Fig.3 Total concentrations of antibiotics in seawater from different sampling sites

不同樣點間抗生素殘留濃度存在類別差異，其中OTC 與其他5 種抗生素具有顯著差異（P<0.05）。在6 種抗生素中，OTC 在不同采樣點海水中殘留量最高，均值為16.20 ng·L?1，其次是TC、DOX、THI 和CIP，均值分別為5.39、4.10、1.84、0.18 ng·L?1，最低的是DAN 均值為0.13 ng·L?1（圖4）。

圖4 采樣點海水中6 種抗生素殘留量均值Fig.4 The mean value of the residue of six antibiotics in the seawater sampled

2.3 不同采樣點海水中抗生素的相似性分析為進一步分析抗生素在各采樣斷面的分布情況，本研究采用主成分分析(PCA)方法對不同采樣點海水中的抗生素相似性進行分析。萬寧和陵水養殖區海水中抗生素PCA 分析結果見圖5，由圖5 可見，主成分P1 的方差貢獻率為46.8%，P2 的方差貢獻率為21.6%，P1、P2 的累積特征值為68.4%；樣點1、2、7、8 距離較近，說明萬寧小海內部間抗生素組成存在相似性，而樣點3、4、10 與其它采樣點距離較遠，表明該采樣點抗生素組成與其他采樣點差異較大，其余采樣點聚集在一起，說明陵水新村與黎安港抗生素殘留存在相似性。

從PCA 排序分布圖（圖5）也可以看出，各采樣點間抗生素的殘留均有一定差異，這可能是各采樣點環境條件不同或抗生素投放量不同導致。要闡明萬寧和陵水養殖區海水中抗生素殘留差異的原因，還需對內海萬寧和陵水養殖區周邊抗生素使用情況和海洋環境現狀進行進一步探究。

2.4 養殖水體中抗生素的生態風險評估根據RQs 風險熵值的計算方法，得出5 種抗生素在不同水體中的RQs 值，最終的評價結果見圖6。遵循RQs 法評估采樣區水體中殘留抗生素對水生生物的生態風險，風險等級依據其大小劃分，RQs≥1 表明高風險，0.1≤RQs<1 表明中等風險，0.01≤RQs<0.1 表明低風險，0.01>RQs 代表無風險。

圖5 采樣點海水中抗生素的PCA 分析Fig.5 PCA analysis of antibiotics in seawater

圖6 采樣點生態風險評估等級Fig.6 Ecological risk assessment grade of sampling site

由圖6 可以看出，大多數采樣區的某一種抗生素的風險熵值（RQs）低于0.01，代表僅這一種抗生素在此區域無生態風險；環丙沙星（CIP）只在港門嶺（采樣點3）和安坡海入海口（采樣點7）被檢測出，且對水生生物皆有低生態風險；在萬寧（采樣點3、6、7）和陵水新村港（采樣點4、9、10）的樣點中強力霉素（DOX）的殘留存在有低生態風險；在陵水新村港（采樣點4、9、10）的樣點中，土霉素（OTC）的殘留存在有低或中生態風險。港門嶺（采樣點3）和新村漁港（采樣點10）的聯合風險熵值（RQsum）處于中風險，其余地區聯合風險熵值（RQsum）處于低風險。

3 討 論

3.1 采樣區抗生素殘留類型由于萬寧、陵水內海的魚排網箱養殖具有一定規模，且養殖人員將抗生素藥物混入飼料進行喂食或直接投入海水中，因此，引起萬寧、陵水內海發生抗生素污染。在對萬寧和陵水養殖區海水抗生素檢出進行分析時發現，四環素類抗生素（TC、OTC、DOX）在兩區域各個點皆被檢出，而磺胺類抗生素未被檢出。四環素類抗生素可能是該地區水產養殖常用的抗生素，可用于預防魚類的細菌性疾病如腸炎病、爛鰓病、赤皮病、細菌性敗血癥、豎鱗病、爛鰭病和海水魚類弧菌病等，龜鱉類和甲殼類的細菌性疾病等。氯霉素類的甲砜沙星用于治療魚類細菌性敗血癥、腸炎及赤皮病[7]，僅有一處采樣點未檢出，這可能與當地水產養殖區魚類發病情況有關。含有環丙沙星的水產用抗生素獸藥名稱為鹽酸環丙沙星、鹽酸小檗堿預混劑，可用于治療鰻魚頑固性細菌性疾病[17]。根據中華人民共和國農業部第235 號公告（動物性食品中獸藥最高殘留限量）[18]和NY5070—2002（中華人民共和國農業人行業標準《無公害食品 水產中漁藥殘留限量》）[18]，從本研究樣品中檢測出的土霉素、四環素、強力霉素和甲砜霉素皆為水產中可使用抗生素；獸藥典（2005 版）-獸藥使用指南（化學卷）[17]中將鹽酸環丙沙星預混劑列為水產養殖用藥名錄，但在《無公害食品 水產中漁用藥物使用準則》[17]中將環丙沙星列為禁用藥物；丹諾沙星并非水產使用抗生素，而是迄今治療畜禽支原體感染最有效的藥物之一，可能是由周圍畜禽養殖場排入海域的。對萬寧和陵水養殖區15 處采樣點海水中抗生素組成進行對比分析，發現9 處采樣點抗生素種類相同，這意味著各采樣點水產養殖的養殖品種、水文條件、地理條件存在相似性，僅個別采樣點使用了喹諾酮類抗生素。本研究對萬寧、陵水內海中4 類40 種抗生素進行檢測，其中僅6 種被檢出（THI, CIP,DAN, DOX, TC, OTC），可見養殖區海水中使用的抗生素比較單一。

3.2 采樣區抗生素殘留濃度及分布特征本研究待測區域各海水樣品中總的抗生素殘留濃度范圍為10.28～156.63 ng·L?1，遠遠低于廣西羅非魚主產區養殖池塘的檢出量（52～3 257.7 ng·L?1）[19]，同時也遠遠低于江蘇典型中華絨螯蟹養殖區中抗生素的檢出量（17.04～1 311.93 ng·L?1）[20]，但與廣州市南沙水產養殖區抗生素殘留量（18.13～61.34 ng·L?1）相比處于相對較高水平[21]，與北部灣河口養殖區（22.4～118 ng·L?1）[22]、渤海灣近岸海域（24.3～242.7 ng·L?1）[23]、豐水期洞庭湖水體檢出量（6.35～135.40 ng·L?1）相近[24]。在四類抗生素中四環素類抗生素檢出水平最高，這與渤海灣近岸海域[23]中檢測結果相似。四環素類殘留濃度均值為25.7 ng·L?1，低于渤海灣近岸海域中四環素類抗生素的檢出量均值（200.9 ng·L?1）[23]，高于洞庭湖水體均值（3.96 ng·L?1）[24]；在四環素類抗生素中OTC 檢出濃度最高，均值為16.2 ng·L?1，與渤海灣近岸海域OTC 檢出濃度均值（69.8 ng·L?1）[23]相比處于相對較低水平。喹諾酮類抗生素檢出0～1.59 ng·L?1，低于北部灣養殖區養殖塘喹諾酮類抗生素檢出濃度（16.9～78.5 ng·L?1）[22]，與北部灣養殖區遠海[22]相近。氯霉素類抗生素僅有1 種（THI）被檢出，檢出均值為1.84 ng·L?1，其他地區鮮有報道。

與國內部分水域研究[23，25?29]相比，萬寧和陵水養殖區海水的抗生素殘留處于相對較低水平，這可能與樣品采集區域有關，其他研究樣點布設主要位于北方或較為封閉小型的水域，而本研究樣點布設在萬寧、陵水內海中，其抗生素主要來自海水水產養殖；與其他水體環境研究相比，萬寧、陵水養殖區海水中抗生素殘留濃度處較低水平，這意味著內海養殖區抗生素使用量較低及內海與外海海水交換量大，也可能是由于海南省南部日照充足、海水溫度較北方稍高、多處海水pH 偏堿性從不同程度上有利于抗生素的降解[30?32]。在本研究中，喹諾酮類相對于四環素類及氯霉素類型抗生素而言其檢出量較低，且喹諾酮類相較于四環素類不易水解，這意味著萬寧及陵水內海養殖區較少使用喹諾酮類。而相對其他3 類抗生素來說，磺胺類抗生素不易水解而易發生光解，在萬寧和陵水養殖區海水中磺胺類抗生素未被檢出，說明萬寧和陵水養殖區磺胺類抗生素使用量極低。

3.3 采樣區抗生素生態風險水平海南島東部海水中抗生素殘留對采樣區域的影響基本處于中等以下風險水平,但有研究[33]表明，抗生素殘留可能會對水生生物產生急性或慢性毒性效應，同時抗生素的長期殘留還可能會刺激病原菌產生耐藥性，誘導抗性基因產生，這勢必會對原有穩定的生態系統產生影響。因此，海南島東部海水研究區水體中抗生素整體存在一定的生態風險，陵水新村漁港水體中土霉素對相應敏感物種具有中風險，但從維護生態系統出發也應該減少環丙沙星（CIP）、強力霉素（DOX）和土霉素（OTC）的使用。