循環腫瘤細胞的“舊語新說”

王硯春，楊曉蓉，郭 林，盧仁泉△

1.復旦大學附屬腫瘤醫院檢驗科，上海 200032；2.復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032

傳統的組織活檢作為腫瘤診斷的“金標準”，其侵入性取材的限制致使組織活檢無法實時掌握腫瘤異質性的動態變化。液體活檢技術的問世，擺脫了傳統組織活檢的取材束縛，受到臨床的廣泛關注。循環腫瘤細胞(CTC)作為液體活檢技術的重要成員，能動態反映腫瘤的實時狀態，在個體化治療的療效監測與預后評估中發揮重要作用，具有廣闊的應用前景。

1 CTC概述

CTC是指從原發腫瘤中游離出來，進入血液或其他體液的腫瘤細胞[1]。雖然THIELE等[2]較早就提出了CTC的概念，但CTC在外周血中十分稀有，僅少量上皮間質轉化細胞或侵襲性腫瘤細胞能夠侵入血液，只占所有腫瘤細胞的0.000 000 1%[3]、外周血有核細胞的0.000 1%(1～10個細胞/mL)[2]，所以通過常規檢測方法幾乎無法識別。

2 CTC的檢測技術

隨著檢測技術的發展，經過分離、富集、標記、鑒定等步驟，捕獲并檢測體液中微量的CTC已得以實現。此外，CTC未經富集的直接檢測技術[4]、體內置入的實時富集技術[5]，也已轉化為臨床應用。

2.1CTC的分離與富集 CTC的分離與富集主要依據腫瘤細胞的物理性質和生物學特性進行，包括基于細胞大小、密度、電荷的細胞過濾法，密度梯度離心法，介電泳分離法，以及依賴細胞生物標志物的陽選與陰選策略等。

CellSearch檢測系統是美國食品藥品監督管理局(FDA)批準的首個CTC檢測方法[6]。這項技術采用上皮細胞黏附分子抗體，捕獲具有上皮間質轉化特征的CTC[7]。無獨有偶，我國CFDA也批準了Ⅲ類醫療器械CTC采樣針CellCollector，其隨著全身血液循環不斷捕獲細胞，提高了CTC的檢測靈敏度[5]。近年來，與微流控技術相結合的CTC富集方法樹立了CTC檢測的新里程碑。微流控技術不僅可以保持CTC分離的效率和純度，而且可以確保CTC的完整性和活性[8]。同時，新近興起的其他CTC分離方法也大大提高了檢測效率、降低了檢測成本；但是，每種分離富集與方法均存在一定的局限性，見表1。

表1 CTC分離與富集方法比較

2.2CTC的標記與鑒定 分離與富集后的CTC需要進一步進行染色標記與鑒定，經典的標記鑒定方法包括細胞免疫熒光技術、PCR方法等；其中最常用的方法為細胞免疫熒光技術，通過熒光顯微鏡檢測結果將角蛋白陽性，CD45陰性和4′,6-二脒基-2苯基吲哚陽性的細胞定義為CTC[9]。

美國FDA批準的CellSearch檢測系統，就是以形態學與表面標志物為主要診斷依據，可用于監測轉移性乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌的預后[10]。這項技術如何結合核酸分子等進行特異性鑒定，全面獲取腫瘤細胞的攜帶信息，避免干細胞假陽性污染，提高捕獲效率與診斷性能，是CTC檢測重返市場需要攻克的難關[10]。

近年來，采用葉酸受體免疫磁珠負向篩選聯合靶向熒光定量PCR方法(國械注準20163400061)，從一定程度上彌補了上述CellSearch檢測CTC的缺陷，能夠靶向并定量檢測人全血中葉酸受體陽性的腫瘤細胞，可用于早期肺癌患者的輔助診斷及非小細胞肺癌患者的療效監測[11]。

CTC測序技術能夠精準反映腫瘤體細胞變異和基因表達變化，使全面檢測分析CTC成為可能[12]。CHENG等[13]開發的Hydro-Seq平臺，可以對CTC進行單細胞轉錄組分析，從分子層面分析CTC的基因表達圖譜，不僅有助于CTC亞型分類、提供腫瘤異質性參數，而且通過雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長因子受體2(HER2)等藥物靶標的分析還為激素和靶向藥物的使用提供依據，突顯了CTC測序在精準醫學中的潛在價值。

3 CTC的臨床應用情況

在腫瘤診斷過程中，腫瘤異質性會帶來檢測對象的隨機選擇，腫瘤組織活檢的細針抽吸對腫瘤腫塊的部分取樣，不能反映腫瘤組織的全貌。從原發腫瘤脫落的CTC，攜帶有腫瘤的全面信息，在腫瘤相對早期階段即可從體液中分離出來，比發現原發腫瘤腫塊或轉移灶的常規檢測方法更為靈敏，因此在腫瘤的臨床診療中發揮著重要作用。

3.1CTC與腫瘤早期輔助診斷 腫瘤的早期輔助診斷一般依賴于影像學與腫瘤標志物的檢查，但對于最大徑小于5 mm的腫塊，影像學難以發現[14]；同時大部分腫瘤標志物的特異度不高，不能作為診斷的獨立指標，目前腫瘤早期輔助診斷的方法仍具有一定的局限性。然而CTC的檢測靈敏度相對較高，對腫瘤的早期發現有著重要價值。

ILIE等[15]發現，對慢性阻塞性肺疾病患者進行CTC檢測并隨訪，檢出CTC的患者在之后的隨訪期間均發現罹患肺癌，真正做到了腫瘤的早發現、早診斷。YIN等[16]使用葉酸受體富集CTC，對肺癌診斷的靈敏度為87.1%，相比常用的篩查方法——低劑量計算機斷層掃描更加便捷、省時。CTC與傳統的血清腫瘤標志物相比，也展現出在早期診斷方面的巨大潛力。吳方等[14]發現CTC診斷肺癌的靈敏度、特異度分別為77.1%、89.6%，均高于傳統血清腫瘤標志物(神經元特異性烯醇化酶、糖類抗原125、糖類抗原153、細胞角蛋白19的可溶性片段、鱗狀上皮細胞癌抗原等)。GUO等[17]使用帶有陰性選擇的定量PCR平臺，對具有干細胞表型的CTC進行檢測，發現對早期肝癌患者的診斷特異度為94.2%，診斷性能比血清甲胎蛋白更好。

當然，由于CTC捕獲效率的差強人意，CTC檢測仍面臨著巨大挑戰。CTC分離鑒定方法的局限性，易造成CTC的丟失或者誤判，從而出現假陰性或假陽性結果。在基于核酸檢測的技術中，雖然具有較高的靈敏度，但仍需要解決CTC損耗、純度低、檢測譜窄等問題[18]。近年來，不少新興技術的出現為CTC檢測具有更高的靈敏度和特異度提供了新方向，例如Ephesia CTC芯片將免疫磁珠技術與微流控技術相結合，可將CTC的捕獲效率提高到90%～94%，檢測特異度達到99.6%[19]。

此外，使用CTC和循環腫瘤DNA(ctDNA)相結合的檢測方法，可以進一步提高液體活檢的敏感性[20]。在一項針對多發性骨髓瘤患者的研究中發現，ctDNA與富集的CTC之間沒有直接相關性，CTC和ctDNA具有不同的遺傳突變譜[21]。因此，結合CTC和ctDNA的檢測方法可以在不降低特異度的情況下相互補充，更靈敏地檢測腫瘤特異性基因的改變，有助于腫瘤的精準檢測。

3.2CTC與腫瘤療效的關聯 隨著多種新輔助療法的應用，以及腫瘤靶向治療理念的革新，傳統監測腫瘤療效的方法已無法為臨床提供及時準確的療效信息[22]，CTC檢測在腫瘤療效監測方面賦予了重要作用。首先，通過檢測CTC的組分蛋白，有助于臨床治療方案的選擇。例如，在乳腺癌患者中，CTC表面的HER2狀態可以輔助指導靶向藥物的使用，即使是原發腫瘤HER2陰性的患者，也可因為檢測到HER2陽性的CTC，從而采取有效的靶向治療并從中獲益[23]。同樣，FUJII等[24]在轉移性乳腺癌患者中分析ER的表達，發現在原發腫瘤ER陽性的患者中，出現了ER陰性的CTC，能夠解釋ER靶向治療失敗的原因，得出監測CTC的ER表達可以優化乳腺癌治療的結論。

CTC表面標志物也有助于免疫療法的評估；CTC檢測可能成為一種可靠的方法，反映腫瘤整體的生物學特性，對免疫治療策略的抉擇至關重要[25]。例如在胃腸道腫瘤中，CTC表面的PD-L1表達水平可作為篩查PD-1/PD-L1阻斷療法的預測指標，關注CTC的動態變化可監測免疫治療的有效性[26]。此外，在晚期非小細胞肺癌患者的自然殺傷細胞治療后，CTC數量的減少與治療療效密切相關，CTC也是評估自然殺傷細胞療法療效的標志物[27]。

其次，CTC計數和表面標志物是監測疾病進展、治療的有力工具，其內部的核酸組分也具有提供臨床治療信息的巨大潛力[28]。一些研究表明，僅CTC計數不足以指導治療決策，但對CTC進行核酸分析，可以輔助靶向治療方案的確定[29]。例如通過篩選CTC中的鼠類肉瘤病毒癌基因、表皮生長因子受體、HER2、ER等基因突變，將CTC基因組與原發腫瘤基因組進行差異分析，能為靶向治療動態監測提供新的見解[30]。對CTC進行RNA分析可用于耐藥相關分子的鑒定。MIYAMOTO等[31]對前列腺癌患者外周血CTC進行單細胞RNA分析，發現CTC與原發腫瘤之間存在表達譜差異，相關信號通路的異質性是導致雄激素治療無效的原因。在局部晚期直腸癌的CTC中，通過原位雜交檢測胸苷酸合酶mRNA發現，胸苷酸合酶 mRNA表達的患者不存在病理完全緩解的情況，對新輔助化療不敏感，提示CTC的核酸分析可準確預測病理完全緩解情況，從而免除根治性手術的可能[32]。

最后，CTC可作為探索腫瘤新生細胞和治療策略研究的新手段[33]。從晚期腫瘤患者中分離出的CTC可制備異種移植物，進行功能表型和藥理研究；制備離體培養物，進行藥物篩選和全基因組、蛋白質組分析等[34]。ZHANG等[35]從間變性淋巴瘤激酶(ALK)陽性肺癌患者中獲得CTC進行離體培養，并用2種ALK抑制劑：賽可瑞和色瑞替尼進行藥物敏感性測試，發現色瑞替尼是一種更有效的ALK抑制劑。這種通過分離CTC建立體外模型、進行個體化藥物治療的研究，為CTC在療效監測方面的轉化應用打開了新的思路。

3.3CTC與腫瘤患者預后 通常情況下，CTC數量隨著腫瘤遠處轉移的進展而增加，研究發現CTC計數與無進展生存期(PFS)和總生存期(OS)密切相關，可作為評估臨床預后和復發風險的重要依據[36]。在早期前列腺癌、乳腺癌和結直腸癌中應用的CellSearch系統，每7.5 mL外周血中有≥5個CTC是PFS減少的有效預測指標[37]。

此外，CTC表面特異性標志物的變化對判斷腫瘤的預后情況有重要價值。SPARANO等[38]在乳腺癌復發患者中發現，ER陽性CTC患者比ER陰性CTC患者的復發風險高13.1倍。WANG 等[39]發現在放療后的轉移性肺癌患者中，CTC PD-L1的表達增加與預后不良相關，PD-L1陽性的CTC可作為惡性腫瘤預后的標志物。

在核酸水平上，一項Meta分析發現，在非轉移性結直腸癌中，通過PCR方法檢測CTC陽性患者的OS和無病生存期(DFS)較CTC陰性患者明顯縮短；并且CTC與許多預后不良指標相關，如淋巴結轉移、血管侵犯、腫瘤分化程度低、TNM晚期等[40]。通過數字PCR方法檢測胰腺癌患者CTC的基因表達，發現未經治療的胰腺癌患者其CTC中具有較高的ALCAM、POU5F1B和SMO mRNA表達水平，這些患者的PFS和OS明顯縮短[41]。HINZ等[42]使用CK20實時熒光定量PCR方法檢測CTC，發現其是結腸癌的獨立預后標志物，CTC陽性患者的復發風險明顯升高。

早在2010年美國癌癥聯合委員會制訂的《腫瘤分期指南》中，已把CTC列入TNM分期系統[43]。cM0(i+)微轉移的分期概念出現在傳統檢測方法認定腫瘤尚未達到M1水平，但循環體液中卻能檢出CTC的腫瘤轉移早期階段。雖然這種分期在臨床實踐中很少使用，CTC能否作為可靠的分期標準還有待商榷，但是CTC作為腫瘤分期的重要工具，已受到廣泛重視。例如在胃癌中，CTC≥4的患者比例隨著腫瘤分期的增加而增加，胃癌患者處干腫瘤分期Ⅳ期時其比例可高達95.24%[44]。CRISTOFANILLI等[45]分析了2 436例復發轉移性乳腺癌患者，將每7.5 mL 5個CTC設為臨界值進行分層，CTC≥5被列為Ⅳaggressive期，CTC<5為Ⅳindolent期，并且使用Kaplan-Meier曲線和Log-rank檢驗分析發現前者的OS明顯縮短(16.0個月vs.36.3個月，P<0.001)，從而證明CTC是轉移性乳腺癌Ⅳ期分層的理想標志物。

4 結語及展望

CTC檢測作為液體活檢技術的重要成員，在腫瘤診療方面發揮重要作用。CTC攜帶了原發腫瘤的異質性信息，可作為一種有效的生物標志物和模型工具。通過非侵入性活檢、分離并鑒定的CTC，在腫瘤早期診斷、實時療效監測和預后評估等方面得到廣泛應用。但是，目前CTC檢測在檢測技術的優化、臨床應用的完善上仍然有著較大的提升空間。一方面CTC檢測技術仍在不斷更新，新興發展的檢測技術需要充分驗證，獲得批準才能進入臨床；另一方面，腫瘤異質性一直是腫瘤診療的一大難題，CTC異質性能否反映腫瘤全貌，在臨床應用上仍然面臨著挑戰。

隨著科技不斷進步，在單細胞水平上對CTC進行基因組、轉錄組、蛋白質組分析，以及CTC體外模型的不斷完善[46]，可促進腫瘤研究的不斷深入，為腫瘤診斷、治療、預后、病因機制和藥物開發等領域開拓新的視野。相信在不久的將來，隨著技術的持續改進、標準化方案的制訂、待解決難題的不斷攻克，CTC檢測將會為腫瘤臨床診療帶來更多便利。