腓骨肌萎縮綜合征患者MFN2基因突變檢測的研究

劉紅仙，段麗芬，劉曉梅，王惠萍，王曉輝，褚嘉祐，孫 浩，楊昭慶△

1.中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所，云南昆明 650118；2.云南省昆明市兒童醫院，云南昆明 650228

腓骨肌萎縮綜合征(CMT)是一類外周神經退行性遺傳病，具有顯著的臨床表型和遺傳異質性[1]。CMT在普通人群中的患病率約為1/3 300[2]。CMT一般最早的癥狀是由足部肌肉萎縮引起，常導致足部畸形，例如高足弓、平足或卷曲腳趾，下肢腿部難以彎曲。CMT有明顯的臨床異質性，常難以明確認知和診斷。CMT通常在青春期或成年早期表現出明顯癥狀，但是發病時間可能是兒童早期到成年后的任何時候。即使是同一家庭的成員，CMT癥狀的嚴重程度和發病年齡也有所不同。基于對CMT發生發展的認知及臨床診治的現狀，本研究擬利用全外顯子組測序(WES)對1個疑似CMT核心家系的致病突變進行鑒定和遺傳學分析，旨在探討引起突變的原因，進而證實該突變的致病性，為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 1個核心家系來自云南省，包括先證者及其父親、母親和妹妹。先證者，男，10歲，表現出足部畸形，發病于3歲左右；先證者父親未見四肢肌張力及功能等表型異常；先證者母親自述8～9歲逐漸出現行走姿勢異常及四肢肌肉萎縮，后出現下肢癱瘓，現僅能獨坐，不能站立和行走，四肢纖細、消瘦，肌容積明顯減少；先證者妹妹病史與先證者類似。該家系中的3例患者因四肢功能表現異常入院治療，疑似肌張力障礙，但是具體原因仍需進一步檢查和確診。

1.2方法

1.2.1外周血全基因組DNA的提取 根據知情同意原則，獲取該核心家系中所有成員的抗凝外周靜脈血5 mL，采用AxyPrepTMBlood genomic DNA Miniprep Kit試劑盒(購自江蘇康寧生命科學有限公司)提取基因組DNA。

1.2.2WES檢測 采用IIlumina NovaSeq高通量雙端(Pair-end 150bp)測序平臺(購自北京貝瑞和康生物技術有限公司)對先證者基因組DNA全外顯子組進行WES檢測，其簡要流程如下：將1 μg基因組DNA隨機打斷成150～200 bp的片段，然后通過PCR擴增進行標本標記和富集DNA，將構建好的文庫與已標記的RNA探針進行液相雜交，利用標記磁珠捕獲目標區域，構建小片段測序文庫。測序檢測完成后，經堿基識別轉化為原始序列數據，通過變異位點檢索系統和變異位點注釋系統對測序數據進行數據產量統計及單核苷酸多態性、插入和缺失檢測及注釋。以2015年美國醫學遺傳學與基因組學學會(ACMG)發布的遺傳變異分類標準與指南及2016年發布的二級發現報告指南SFv2.0為指導[3]，參考單核苷酸多態性數據庫和人類基因突變數據庫，篩選致病突變位點。根據SIFT、Polyphen-2、Mutation Taster軟件對其突變位點進行評分并預測其致病性。SIFT分值為該變異對蛋白質的影響，分值越小越有害；Polyphen-2分值為Human Div數據庫預測該變異對蛋白序列影響的分值，適用復雜表型中罕見等位基因位點突變的診斷，分值越大越有害，表明該單核苷酸多態性導致蛋白結構或功能改變的可能性越大；Mutation Taster分值為Mutation Taster軟件的預測結果，分值越大結果越可靠。

1.2.3線粒體融合蛋白2(MFN2)位點Sanger測序驗證 用PCR-Sanger測序對該核心家系4例患者進行突變位點的檢測。在美國國立生物技術信息中心上在線合成1對包含MFN2基因(NM_014874.3)c.1090C>T p.R364W突變位點的特異性擴增引物，其中，正向引物序列為5′-TCC CTG GCA GTG AAA ACC AG-3′，反向引物序列為5′-CAG GGA AAG GGC TCT GGA TG-3′。40 μL的反應體系為40 ng基因組DNA約10 μL，10 μmol正反向引物各1 μL，2×PCR Master Mix 20 μL，用去離子水補足至40 μL。PCR反應條件為94 ℃預變性2 min，94 ℃ 45 s；55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 延伸5 min。PCR產物經凝膠鑒定后進行Sanger測序。采用Geneious 11.1.5生物信息學軟件對測序結果進行序列比對和分析。

2 結 果

2.1臨床表型 檢測結果顯示先證者四肢肌張力升高，雙上肢肌力Ⅳ～Ⅴ級，雙下肢肌力Ⅳ級，姿勢異常：前臂內旋，馬蹄內翻足，踝關節趾曲、翻轉，足趾屈曲，步態蹣跚不穩，下肢無力，手指關節攣縮無法伸直。四肢多條受檢神經運動、感覺傳導功能異常，表現為：(1)雙側脛、腓總、正中、尺神經復合肌肉動作電位(CMAP)均未引出；雙側股、橈神經CMAP波幅降低；(2)各受檢神經F波均未引出；(3)各受檢神經感覺神經動作電位均未引出。神經傳導檢測結果提示有四肢廣泛性周圍神經病變，傳導阻滯，軸索病變為主可能，遠端重于近端。

2.2WES結果 本研究利用WES技術對先證者進行檢測并分析其結果，根據ACMG指南，在人類外顯子數據庫東亞人群(ExAC_EAS)中未發現MFN2基因c.1090C>T突變；經計算機輔助藥物設計和神經網絡領域對抗性訓練等對其進行保守性預測，結果顯示該位點進化上保守，具有潛在的功能影響；該位點致病性預測皆顯示有害。提示先證者MFN2基因c.1090C>T為1個疑似致病的突變位點。 見表1。

表1 MFN2基因c.1090C>T p.R364W突變位點致病性預測

2.3Sanger測序結果 PCR-Sanger測序結果顯示先證者、母親及妹妹均為MFN2基因單堿基雜合突變c.1090C>T p.R364W，其父親在該位點為野生型，未見堿基突變，表明WES預測正確，見圖1。

注：A為CMT患者家系圖譜，一共4名成員，包括3例患者，Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅱ2分別為父親、母親、先證者妹妹及先證者(箭頭指示為先證者)；Arg/Trp為精氨酸到色氨酸的氨基酸改變；B為MFN2基因PCR-Sanger測序結果。

3 討 論

CMT是一類周圍神經遺傳性感覺損傷和運動神經損傷的疾病。周圍神經可以將大腦和脊髓連接到肌肉和末端感覺細胞，這些細胞可以感知觸摸、疼痛、熱量和聲音等。周圍神經軸突的異常會引起肌張力異常，腓骨進行性肌肉萎縮足部畸形，遠端無力，感覺喪失和視神經萎縮等[4]。隨著疾病的發展，患者小腿的肌肉通常會萎縮，到晚期可能需要使用輪椅。CMT患者通常對足和小腿的觸摸、疼痛及熱量的敏感性較低，但偶爾會感到疼痛或灼痛感。在極少數情況下，受影響的患者會失去視力或逐漸喪失聽力，甚至導致患者耳聾。盡管在大多數患者中，CMT不會影響預期壽命，較多患者僅產生中等程度的身體殘疾，癥狀輕微，甚至可能不會出現明顯的臨床表型。但是，在極少數情況下，CMT也有可能會危及患者生命[5]。

根據遺傳方式，CMT可表現為常染色體顯性和隱性，以及X-連鎖顯性和隱性遺傳，其中以常染色體顯性遺傳多見，此外還有少數純合或復合雜合突變。根據神經病理學和電生理學標準，CMT被分為2個類型：脫髓鞘型(CMT1)和軸突型(CMT2)，CMT2又包括CMT2A 、CMT2B和CMT2D等[6]。CMT2A(OMIM：608507)中最常見是MFN2基因突變，約占所有基因突變的20%。MFN2是CMT2主要的致病基因，突變頻率為8%～30%。MFN2是編碼線粒體GTP酶的核基因，與線粒體融合蛋白1、神經節苷脂誘導分化相關蛋白1和視神經萎縮1相互作用，對線粒體的結構完整性、形態和運輸至關重要[7]。MFN2通過影響氧化磷酸化而參與能量代謝[8]。MFN2與Ca2+的吸收調節有關，促進內質網-線粒體的結合[9]。已有研究報道了罕見的MFN2復合雜合或純合突變病例[10]。這有助于擴大與MFN2相關的神經疾病的遺傳特征范圍。在臨床上，與MFN2相關的CMT2A發病特征可以從輕度的遲發性神經疾病到嚴重的早發性神經疾病[11]，其表型通常比單純的周圍神經疾病復雜，有聽力損失、視神經萎縮或錐體束征等其他特征[12]。有研究報道了15例CMT2A患者，他們均是MFN2突變的復合雜合子或純合子攜帶者，具有常染色體隱性遺傳或半顯性遺傳，這些患者通常表現出嚴重的早期發作性神經疾病，也有較輕的兒童期發病病例，有嚴重表型的患者通常會在30歲左右因下肢癱瘓需要乘坐輪椅，并合并其他發病特征[13-15]。已有研究表明，MFN2基因突變位點c.1090C>T的主要臨床癥狀是視神經萎縮等，該位點位于MFN2蛋白高度保守的R3區，是1個突變熱點[16]。

在本研究的核心家系中，先證者、母親及妹妹均為MFN2基因c.1090C>T單堿基雜合突變，其父親在該位點為野生型，未見堿基突變。先證者主要顯示出輕度的營養不良和下肢無力，發病時間為3歲左右；先證者母親8～9歲逐漸出現姿勢異常及肌肉萎縮，后出現癱瘓，現僅能獨坐，不能站立和行走，四肢纖細、消瘦，肌容積明顯減少；妹妹病史與先證者類似；先證者父親表型未見異常。先證者及其妹妹都表現出較早、較輕的兒童期發病，目前已經采用手術矯正的方法逆轉其手足畸形，并配合其他方法盡量維持其肌肉的自主能力[17]。其母親因發病時間較長且前期未做相關檢查和治療，目前已出現下肢癱瘓，無法行進一步干預。由于目前無法采集到除該核心家系以外的先證者其他家族成員的基因，所以僅能推斷先證者及其妹妹的雜合突變來源于其母親，但是無法推斷其母親突變基因的來源，需要擴大其家庭的臨床、神經生理和分子研究，從而確定致病作用和遺傳模式的可能性。因此，在向患者及其家屬披露基因檢測結果和遺傳咨詢之前，需要仔細收集家族史并對健康的親屬進行分析。此外，由于外顯率不完全，復發風險可能大不相同，必須將有關基因檢測的不確定性充分告知患者，以便患者可以更好地了解自己的病情。

綜上所述，本研究基于患者的臨床表型，以WES和PCR-Sanger測序方法，在1個核心家系中檢測并鑒定了3例攜帶MFN2基因單堿基雜合突變的患者。之前的報道顯示此突變主要是以視神經萎縮為主要臨床癥狀，與本研究中報道的四肢發病特征不同，也證實了CMT具有明顯的臨床異質性，常難以明確認知和診斷，需要與其他疾病正確進行區分。