Super-ARMS PCR和ddPCR檢測晚期肺腺癌患者血漿循環腫瘤DNA EGFR基因T790M突變的臨床價值研究

許萬星，王 琳，郭巧梅，黃 霞，婁加陶

上海交通大學附屬胸科醫院檢驗科，上海 200030

有研究表明，表皮生長因子受體抑制劑(EGFR-TKI)在晚期非小細胞肺癌的治療中取得突破性進展，對表皮生長因子受體(EGFR)基因藥物敏感性的突變患者，EGFR-TKI的療效明顯高于標準化療方案[1-2]。但是約50%耐藥患者經EGFR-TKI治療后可檢測到T790M突變[3]。第三代靶向藥物對經過第一、二代EGFR-TKI治療后耐藥患者有良好的效果[4]。研究證實肺癌患者外周血中循環腫瘤DNA(ctDNA)可用于檢測EGFR突變和EGFR-TKI療效監測[5-7]。目前，臨床實驗室檢測ctDNA基因突變常用的方法包括超級擴增阻滯突變系統PCR(Super-ARMS PCR)、微滴式數字PCR(ddPCR)等。Super-ARMS PCR檢測特異度高，但靈敏度相對較低[8]。ddPCR檢測靈敏度高且絕對定量。本研究以經過EGFR-TKI治療后耐藥的晚期肺腺癌患者為研究對象，分別采用Super-ARMS PCR和ddPCR檢測ctDNA中T790M突變，比較2種方法的一致性和檢出率，同時討論檢出率與用藥時間的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年6月至2019年12月本院確診的肺癌患者124例。納入標準：(1)經病理組織和分子分型確認為EGFR敏感突變型腺癌；(2)接受EGFR-TKI治療，根據實體瘤的臨床療效評估標準出現一個或多個新病灶和(或)存在非目標病灶進展；(2)臨床資料完整，包括性別、年齡、吸煙史、腫瘤分期、病理組織類型、用藥時間和隨訪等。(3)有充足的血液標本。排除標準：(1)合并有嚴重心血管系統疾病；(2)近期內使用過免疫抑制劑。本研究經本院醫學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。患者一般資料見表1。

表1 患者一般資料

1.2儀器與試劑 ABI 7500實時熒光定量PCR儀、QubitTM熒光定量儀均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；QX200TMDroplet DigitalTMPCR System ddPCR儀、QX200 Droplet微滴生成儀、微滴閱讀儀、ddPCRTMSupermix for Probes(No dUTP)、ddPCRTMprobe assay Kit均購自美國Bio-Rad公司；DK-S12型電熱恒溫水浴鍋購自上海森信實驗儀器有限公司；OSE-100C恒溫金屬浴購自北京天根生化科技有限公司；YB-DX23D電動吸引器購自上海斯曼峰有限公司；QIAamp游離核酸純化試劑盒購自德國Qiagen公司；人類EGFR基因突變檢測試劑盒(多重熒光PCR法)購自廈門艾德生物醫藥公司。

1.3方法

1.3.1標本采集 使用一次性乙二胺四乙酸真空抗凝采血管，采集患者靜脈血8～10 mL，以1 600×g在4 ℃下離心10 min分離上層血漿，以16 000×g在4 ℃下離心10 min，再次分離上層血漿，-80 ℃保存備用。血漿需在采集后2 h內完成分離。

1.3.2血漿ctDNA提取 取上述血漿4～5 mL，按照QIAamp游離核酸純化試劑盒說明書的操作步驟進行血漿ctDNA提取。采用QubitTM熒光定量儀測定提取的核酸濃度，取吸光度(A260/A280)在1.8～2.0的合格標本用于后續EGFR基因檢測。

1.3.3EGFR基因檢測 EGFR基因分別使用Super-ARMS PCR法和ddPCR法進行檢測。Super-ARMS PCR法采用人類EGFR基因突變檢測試劑盒。按照操作流程檢測T790M的突變情況。使用ABI 7500實時熒光定量PCR儀，探針模式設為Reporter Dye：FAM、VIC、ROX、CY5；Quencher Dye：TAMRA；Passive Reference：NONE。總反應體系72 μL：2.5 μL P-EGFR反應液，67.5 μL待測樣品；2 μL P-EGFR混合酶。PCR反應程序：95 ℃ 10 min，1個循環；95 ℃ 40 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，15個循環；93 ℃ 40 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，28個循環；第三階段60 ℃收集FAM/VIC/ROX/CY5信號。

ddPCR法應用ddPCRTM探針檢測試劑盒。反應體系22 μL：EGFR ddPCR Supermix 10 μL,ddPCR T790M探針引物2 μL，待測DNA 10 μL。將反應體系放入8通道微滴生成器中。將生成微滴于QX200TMDroplet DigitalTMPCR System ddPCR儀上進行擴增。PCR反應程序：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，70 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，40個循環；98 ℃溫浴10 min，最后置于4 ℃。PCR反應后，將96孔板置于微滴閱讀儀中，檢測微滴熒光信號。采用QuantaSofrt軟件分析，2個及以上微滴出現FAM信號陽性時，判斷此標本為陽性，否則為陰性。根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例，即可得出靶分子的起始拷貝數或濃度。

1.4統計學處理 采用SPSS20.0統計軟件進行數據處理分析，計量資料以例數和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，一致性分析采用Kappa檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1Super-ARMS PCR法與ddPCR法檢測結果比較 124例患者分別進行ddPCR法與Super-ARMS PCR法檢測EGFR基因T790M突變。其中Super-ARMS PCR法檢出T790M突變38例(占30.65%)，ddPCR法檢出T790M突變50例(占40.32%)。2種方法檢測結果一致性較好(Kappa=0.756，P<0.001)。ddPCR與Super-ARMS PCR法的陽性符合率為74.00%(37/50)，陰性符合率為98.65%(73/74)，總符合率為88.71%(110/124)。14例標本在2種檢測方法中結果出現差異，其中13例在Super-ARMS PCR法中檢測為陰性標本，在ddPCR法中檢測為陽性標本，1例在Super-ARMS PCR法中檢測為陽性標本，在ddPCR法中檢測為陰性標本。見表2、3。

表2 Super-ARMS PCR法與ddPCR法檢測結果比較(n)

表3 14例檢測結果不一致標本的信息

2.2T790M檢出率與用藥時間相關性 所有患者經EGFR-TKI治療后，出現疾病進展的用藥時間中位數為14個月。在所有入組患者中，隨著用藥時間的增加，Super-ARMS PCR法檢出率升高，用藥時間≥12個月患者采用Super-ARMS PCR法檢測T790M突變的檢出率高于用藥時間<12個月的患者(P<0.05)，而ddPCR法在不同用藥時間人群中檢出率比較，差異無統計學意義(P=0.729)。見表4。

表4 T790M檢出率與用藥時間的關系(%)

2.3T790M突變豐度分析 應用ddPCR法檢測出50例T790M突變患者中，突變豐度在0.01%～68.10%。突變豐度≥5%的患者占28.00%(14/50)；突變豐度為1%～<5%的患者占比較高，占38.00%(19/50)；突變豐度<1%的患者占34.00%(17/50)，其中突變豐度≤0.1%的患者占4.00%(2/50)。

3 討 論

隨著腫瘤精準治療時代的到來，分子靶向和免疫治療已經成為熱點。由于大部分腫瘤患者在診斷時已經處于晚期，且預后較差，失去了手術根治的機會，因此化療成為臨床上主要的治療手段。但是一線含鉑兩藥聯合化療的有效率也只有35%左右，同時伴隨十分明顯的藥物不良反應。因此，包含EGFR-TKI在內的分子靶向藥物為晚期非小細胞肺癌患者的治療提供了新的方向。盡管EGFR-TKI治療在EGFR突變的腫瘤患者中取得了比較優異的成效，但是經過一段時間治療后，患者均會出現耐藥情況。第三代EGFR-TKI對出現T790M突變伴疾病進展的耐藥患者有較好的效果。因此在進行第三代EGFR-TKI治療前，對EGFR基因T790M突變的檢測尤為重要。隨著《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》的頒布[9]，臨床上對靈敏度較高的檢測方法的需求更加迫切。目前各實驗室常用的EGFR基因突變檢測方法包括ARMS PCR、Super-ARMS PCR、ddPCR、新一代測序(NGS)等[10-11]。由于ctDNA具有片段小、濃度低、易降解的特點，目前針對ctDNA中EGFR基因突變檢測并沒有公認的“金標準”技術。本實驗室前期建立了ctDNA ddPCR和NGS檢測平臺，經過驗證，ddPCR和NGS的靈敏度基本一致，均可達0.1%[12]。ddPCR不依賴循環閾值或內參基因，可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目，具有絕對定量、靈敏度高、標本需求量低、耐受性高等特點，包括PCR和NGS在內的較多分子生物學檢測技術會利用ddPCR進行比較和驗證。本研究將Super-ARMS PCR法與ddPCR法在ctDNA T790M突變檢出率和一致性方面進行了比較和分析。

本研究中ddPCR法和Super-ARMS PCR法檢測耐藥患者T790M突變檢出率分別為40.32%和30.65%，與研究報道的數據較為一致[13-14]。此外，Super-ARMS PCR法和ddPCR法對晚期肺腺癌患者經EGFR-TKI治療后ctDNA EGFR基因T790M突變檢測具有較高的一致性(Kappa=0.756，P<0.001)，總符合率為88.71%。其中，13例Super-ARMS PCR法檢測T790M突變陰性的患者，利用ddPCR法檢測陽性，通過突變豐度分析，這13例患者的突變豐度較低，在0.01%～2.80%，可能由于Super-ARMS PCR檢測低突變豐度標本時，其檢測性能不穩定。1例Super-ARMS PCR法檢測T790M突變陽性的患者，利用ddPCR法檢測陰性，可能由于ddPCR法操作過程較為復雜，操作不當等因素造成實驗失敗。

耐藥分為原發性和獲得性，原發性耐藥臨床定義為接受EGFR-TKI后第一時間對治療無反應，臨床癥狀、疾病控制或總生存率無明顯改善。獲得性耐藥是指開始EGFR-TKI靶向治療后取得明顯治療效果，但服藥6個月之后，腫瘤病灶不能得到有效抑制，進一步增大，根據相關標準判定為疾病進展。本研究中患者經EGFR-TKI治療后，出現疾病進展的用藥時間中位數為14個月。在124例患者中，隨著患者用藥時間的增加，檢出率也有升高，用藥超過12個月的患者采用Super-ARMS PCR法檢測T790M突變的檢出率高于用藥小于12個月的患者(P<0.01)。說明用藥時間超過12個月，產生耐藥性的患者占比較高，提示臨床可以在這段時間加強隨訪。

本研究應用ddPCR法檢測出50例T790M突變，T790M突變豐度在0.01%～68.10%，其中突變豐度≤0.1%的患者占4.00%。突變豐度在1%～<5%的患者占比最高，占38.00%。當患者血漿中的DNA無法達到Super-ARMS PCR法所能檢測的最低限度時，常被其判為陰性；本研究中，ddPCR法的突變豐度最低可以達到0.01%，可以檢出Super-ARMS PCR法檢測為陰性的標本。

綜上所述，Super-ARMS PCR法和ddPCR法在經EGFR-TKI治療后的晚期肺腺癌患者外周血標本進行EGFR基因T790M突變的檢測中具有較高的一致性，可以為臨床肺腺癌患者靶向治療提供重要參考。但ddPCR法靈敏度更高并且可以通過絕對定量提供突變豐度的信息，后續可針對突變豐度與患者的用藥療效和預后開展研究，從而為臨床治療提供更全面的信息。