RSV下呼吸道感染患兒血清miR-146a、miR-155的表達(dá)及意義

黃 佩，翟 敏，廖廷彥

湖北省棗陽市第一人民醫(yī)院兒科，湖北棗陽 441200

呼吸道合胞病毒(RSV)是嬰幼兒下呼吸道感染的常見病毒，RSV感染可導(dǎo)致免疫損傷，患兒出現(xiàn)咳嗽、氣促、喘憋等癥狀[1-2]。微小RNA(miRNA)可作為免疫系統(tǒng)和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)元件參與人體免疫調(diào)節(jié)[3-4]。miR-146a在體內(nèi)充當(dāng)炎癥調(diào)節(jié)劑，可影響核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)途徑及絲裂原活化蛋白激酶途徑[5]。miR-155在自身免疫和其他慢性炎癥性疾病中發(fā)揮作用，影響機(jī)體炎性反應(yīng)[6-7]。miR-146a和miR-155參與調(diào)節(jié)多種疾病的炎性反應(yīng)，但二者在RSV下呼吸道感染中的作用報(bào)道較少。本研究探討miR-146a、miR-155在RSV下呼吸道感染中的表達(dá)及意義，以期為該病的治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年4月至2019年12月本院就診的97例RSV下呼吸道感染患兒作為試驗(yàn)組，其中男53例，女44例；平均年齡(3.49±1.18)歲。選取同期在本院進(jìn)行常規(guī)體檢的101例健康兒童作為對(duì)照組，其中男59例，女42例；平均年齡(3.67±1.26)歲。2組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。記錄所有受試兒童的身高、體質(zhì)量等，計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(BMI)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)(第8版)》中下呼吸道感染診斷標(biāo)準(zhǔn)者[8]；(2)RSV檢測(cè)呈陽性者；(3)就診前2周未使用激素或藥物治療者；(4)5歲以下兒童。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他慢性疾病者；(2)呼吸道畸形者；(3)先天免疫缺陷者。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試兒童家屬均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 Trizol試劑盒(批號(hào)DXT-15596018)購自上海科敏生物科技有限公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)K1621)購自杭州主諾生物技術(shù)有限公司；SYBR Green PCR Master Mix實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)DXT-ST600580)購自密理博(中國)有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10及超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)分別為ARB13479、ARF11752、ARB10557、AKF00479)購自北京百奧萊博科技有限公司；qPCR儀(型號(hào)100133)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；血細(xì)胞分析儀(型號(hào)DxH800)購自美國貝克曼庫爾特有限公司；希森美康血球儀(型號(hào)XN-2000)購自日本希森美康株式會(huì)社。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 抽取2組兒童的空腹外周靜脈血5 mL，加入乙二胺四乙酸抗凝，4 000 r/min離心5 min，吸取上清液于小型離心管中，分裝于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2血清中炎癥因子及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)血清中TNF-α、IL-6、IL-10及hs-CRP水平；采用血細(xì)胞分析儀測(cè)定血清中血紅蛋白和清蛋白水平；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)白細(xì)胞、紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞數(shù)量。

1.3.3qPCR測(cè)定血清miR-146a、miR-155水平 從-20 ℃取出標(biāo)本，按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，并檢查純度和完整度；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，所得cDNA存于-20 ℃冰箱保存。qPCR反應(yīng)體系(20 μL)：cDNA模板1 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，H2O 8 μL。根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)其上下游引物，以U6為內(nèi)參，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃ 20 s；95 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。根據(jù)各標(biāo)本平均循環(huán)閾值(Ct)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-146a、miR-155水平。

表1 miR-146a、miR-155及內(nèi)參基因U6引物序列

2 結(jié) 果

2.12組一般情況比較 2組BMI、白細(xì)胞、紅細(xì)胞比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；試驗(yàn)組血紅蛋白、清蛋白水平，以及中性粒細(xì)胞數(shù)量均低于對(duì)照組(P<0.05)，淋巴細(xì)胞數(shù)量高于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 2組一般情況比較

2.22組血清miR-146a、miR-155水平比較 試驗(yàn)組血清miR-146a、miR-155水平均高于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表3 2組血清miR-146a、miR-155水平比較

2.32組血清炎癥因子水平比較 試驗(yàn)組血清TNF-α、IL-6、IL-10和hs-CRP水平均高于對(duì)照組(P<0.05)。見表4。

表4 2組血清炎癥因子水平比較

2.4RSV下呼吸道感染患兒血清miR-146a、miR-155水平與炎癥因子的相關(guān)性 RSV下呼吸道感染患兒血清miR-146a、miR-155水平均與TNF-α、IL-6、IL-10和hs-CRP水平均呈正相關(guān)(P<0.05)。見表5。

表5 RSV下呼吸道感染患兒血清miR-146a、miR-155水平與炎癥因子的相關(guān)性

2.5影響 RSV下呼吸道感染的多因素分析 將RSV下呼吸道感染是否發(fā)生作為因變量，以miR-146a、miR-155、TNF-α、IL-6、IL-10、hs-CRP、血紅蛋白、清蛋白、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞作為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示高水平的miR-146a、miR-155、TNF-α和IL-10均是影響RSV下呼吸道感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表6。

表6 影響RSV下呼吸道感染的多因素分析

3 討 論

RSV感染是世界范圍內(nèi)5歲以下兒童死亡的主要原因之一，嬰幼兒易受到RSV病毒感染，其中約2/3為上呼吸道感染，1/3為下呼吸道感染[9]。RSV可導(dǎo)致毛細(xì)支氣管炎，可能會(huì)造成兒童哮喘。RSV感染會(huì)導(dǎo)致肺部損傷，并在兒童生長(zhǎng)階段長(zhǎng)期削弱肺功能，致使持續(xù)的氣道高反應(yīng)[10]。研究表明，在嚴(yán)重RSV感染的嬰兒中TNF-α水平較健康嬰兒高[11]。在RSV感染患兒的洗鼻液中發(fā)現(xiàn)可溶性細(xì)胞間黏附分子-1、IL-10及IL-6水平與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[12]。RSV下呼吸道感染已被證實(shí)與反復(fù)性喘息有關(guān)，并可能在患兒成年后對(duì)其呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生一定的影響[13]。本研究檢測(cè)RSV下呼吸道感染患兒血清中炎癥因子水平，結(jié)果顯示，RSV下呼吸道感染患兒血清TNF-α、IL-6、IL-10和hs-CRP水平均高于健康兒童，與上述結(jié)果一致，提示RSV下呼吸道感染可導(dǎo)致炎性反應(yīng)。臨床上對(duì)于RSV下呼吸道感染暫無有效干預(yù)措施，缺乏特異性治療，因此探尋RSV下呼吸道感染的治療靶點(diǎn)是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

miRNA可參與人體多種生理反應(yīng)，部分miRNA對(duì)炎性反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用。miR-146a是miR-146家族成員，位于人5號(hào)染色體上，可抑制NF-κB通路活化，抑制炎性反應(yīng)或維持免疫穩(wěn)態(tài)[14]。miR-146a在幾種自身免疫性疾病的發(fā)病過程中起重要作用，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、潰瘍性結(jié)腸炎和銀屑病等[15]。GUAN等[16]發(fā)現(xiàn)，在miR-146a轉(zhuǎn)染的人軟骨細(xì)胞中，IL-6、IL-8和TNF-α水平降低，miR-146a可抑制軟骨細(xì)胞中的重要炎癥因子。王盼等[17]研究表明，哮喘兒童血清中miR-146a水平升高，提示miR-146a水平可能與哮喘發(fā)病有關(guān)。miR-155被認(rèn)為是促炎因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而在先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用[18]。miR-155表達(dá)受Toll樣受體/NF-κB通路調(diào)控，其靶基因多為抗炎因子，miR-155通過抑制其靶基因發(fā)揮促炎作用[19]。SINGH等[20]發(fā)現(xiàn)，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清miR-146a、miR-155水平均高于健康人群，并對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有一定診斷價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)，RSV下呼吸道感染患兒血清miR-146a、miR-155水平均高于健康兒童，提示miR-146a、miR-155可能參與RSV下呼吸道感染的發(fā)病進(jìn)程。通過Pearson相關(guān)分析miR-146a、miR-155水平與炎癥因子的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)RSV下呼吸道感染患兒血清miR-146a、miR-155水平均與TNF-α、IL-6、IL-10和hs-CRP水平呈正相關(guān)，提示二者水平能夠反映出RSV下呼吸道感染患兒的炎癥狀況；Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，高水平的miR-146a、miR-155、TNF-α和IL-10均是影響RSV下呼吸道感染的危險(xiǎn)因素，提示降低miR-146a、miR-155水平可能會(huì)抑制RSV下呼吸道感染的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，RSV下呼吸道感染患兒血清miR-146a、miR-155水平較高，二者均是RSV下呼吸道感染的影響因素。提示miR-146a、miR-155可作為評(píng)估RSV下呼吸道感染患兒炎癥狀態(tài)的參考指標(biāo)，有望成為干預(yù)或治療RSV下呼吸道感染的潛在靶點(diǎn)。