不同耐藥表型肺炎克雷伯菌生物膜形成能力與RyhB基因的關聯性

熊流新，陸麗苗，梁啟蘭，黃志偉，李淑英，盤國雄，鐘建輝，陳亞寬

廣東省肇慶市第二人民醫院：1.檢驗科；2.呼吸科，廣東肇慶 526060

肺炎克雷伯菌(KP)是引起醫院內感染和社區感染的重要條件致病菌，可導致多個系統尤其是呼吸系統感染[1]。高毒力肺炎克雷伯菌(HvKP)的特征為高黏性、拉絲試驗陽性，可導致社區型肺炎，感染人群主要為青壯年[2]。隨著三代頭孢的廣泛使用，KP的耐藥率逐年上升，且出現了產超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯菌(ESBLsKP)、多重耐藥肺炎克雷伯菌(MDRKP)和耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)，這類KP引起的呼吸道感染已成為臨床關注的熱點[3-4]。研究表明自然界中絕大多數細菌可以產生生物膜，其細胞外基質參與細菌的黏附、定植過程，生物膜包含的大量黏性基質能形成物理屏障，限制抗菌藥物和炎癥細胞的有效殺傷，生物膜的形成與KP的耐藥性和致病性密切相關[5-6]。RyhB基因屬于非編碼小RNA，研究表明RyhB可以被轉錄但不能被直接翻譯為蛋白，可通過影響細菌生物膜的合成來調節和影響細菌致病性[7-8]。本研究通過分析本院呼吸道感染分離的46株KP的耐藥性和生物膜形成能力，同時檢測RyhB基因，探討不同耐藥表型KP生物膜形成能力與RyhB基因的相關性及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集本院2018年10月至2019年10月不同耐藥表型的46株KP(剔除同一患者的重復菌株)，對其進行細菌培養、分離和純化，根據脈沖場凝膠電泳(PFGE)試驗，剔除型別相似度>85%的菌株。

1.2儀器與試劑 Biofosun微生物鑒定藥敏系統、數字顯示比濁儀購自上海復星公司；超凈工作臺購自蘇州安泰公司；實時熒光定量PCR(qPCR)儀購自美國Bio-Rad公司；全功能微孔板檢測儀購自美國Bio-Tek公司；qPCR試劑盒購自日本Takara公司；細菌總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；液體LB培養基和血平板購自廣州迪景公司；結晶紫購自美國Sigma公司；96孔聚苯乙烯滅菌板購自美國Corning公司；RNA引物購自上海生工公司；質控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603和大腸埃希菌ATCC25922均購自廣東省臨床檢驗中心。

1.3藥敏方法與分組 采用Biofosun微生物鑒定藥敏系統進行細菌鑒定并使用配套藥敏板測定18種抗菌藥物的最小抑菌濃度，依據美國臨床和實驗室標準協會M100-S27藥敏折點判讀結果。KP耐藥分組參考蘇樂斌等[9]的研究，根據抗菌藥物的不同耐藥譜將菌株分為4個耐藥表型。具體分組方法如下：用接種環輕觸血平板過夜培養的新鮮菌落并向外牽拉，重復2次，若2次均有黏液絲生成并且長度>5 mm為拉絲試驗陽性，判斷為HvKP；按標準紙片擴散法同時使用頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢他啶/克拉維酸，任一藥敏紙片加克拉維酸與不加克拉維酸抑菌環直徑之差>5 mm，判斷為產ESBLsKP；對亞胺培南耐藥菌株，參考文獻[8]進行改良碳青霉烯酶滅活(mCIM)試驗，結果陽性判讀為CRKP；對3類或以上抗菌藥物耐藥，不同于HvKP、產ESBLsKP、CRKP分組標準的菌株歸類為MDRKP。

1.4KP生物膜形成能力的檢測 采用96孔聚苯乙烯滅菌板構建KP感染模型，通過結晶紫染色法定量4種不同耐藥表型的吸光度(A)，具體方法參考文獻[10]進行。(1)將46株KP轉種血平板，挑取單個菌落于LB培養基中35 ℃培養24 h；(2)吸取10 μL至LB培養基中進行傳代培養后把菌液調至0.5麥氏濁度，將10 μL菌液接種于含190 μL LB培養液的96孔聚苯乙烯滅菌板(每株設3個復孔)，設置未加菌液的LB培養基為空白對照；(3)35 ℃培養48 h后分離上清液，加入200 μL 1%結晶紫染色液染色20 min，采用ddH2O緩慢沖去未結合結晶紫，每孔加200 μL無水乙醇溶解后采用酶標儀測定590 nm處A值(平行測定3次，取平均值)；(4)結果判讀標準：AC等于空白孔平均A值加其3倍標準差，當A樣≤AC時，結果為陰性無生物膜產生；當AC4×AC時結果為強陽性。

1.5qPCR擴增RyhB基因 依照細菌總RNA提取試劑盒使用說明書提取RNA作為模板。參考文獻[11]設計RyhB基因引物序列(GT44：5′-GGA TCC GCA AGG GTC TCC CTG-3′，GT45：5′-AGA TCT CGG TTC AGC ATG GCG TAT C-3′)和設定PCR反應條件。qPCR擴增RyhB基因過程具體如下：將RNA模板、引物、2×qPCR buffer、Taq Mix溶解后冰上備用，反應體系為25 μL：2×qPCR buffer 12.5 μL，正義引物1 μL，反義引物1 μL，RNA模板1 μL，Taq Mix 0.5 μL，ddH2O加至25 μL。震蕩混勻后短暫離心使溶液收集至管底，將熱循環儀預熱至45 ℃，qPCR反應條件為：反轉錄溫度45 ℃，30 min；95 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。qPCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性產物送上海生工生物工程有限公司進行測序，測序結果在美國國家生物信息中心(NCBI)數據庫進行比對分析。

1.6統計學處理 使用SPSS23.0軟件進行數據處理分析。對數據進行正態性檢驗，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較使用LSD-t檢驗；計數資料以例數和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1KP的耐藥表型分組及臨床分布 46株KP根據不同的耐藥譜特征可分為4個耐藥表型，其中CRKP 6株(占13.0%)，產ESBLsKP 18株(占39.1%)，MDRKP 13株(占28.3%)，HvKP 9株(占19.6%)。46株KP科室來源排名前3為重癥監護室(ICU)11株(占23.9%)，呼吸科8株(占17.4%)，神經外科7株(占15.2%)，見表1。

表1 46株KP的科室分布

2.24種不同耐藥表型KP生物膜形成能力差異分析 5株CRKP為弱陽性、1株CRKP為中等陽性，9株HvKP生物膜形成能力均為弱陽性，18株產ESBLsKP生物膜形成能力均為中等陽性，13株MDRKP生物膜形成能力均為中等陽性。不同組別的生物膜形成能力差異有統計學意義(F=38.444，P<0.05)，CRKP生物膜形成能力低于產ESBLsKP、MDRKP(P<0.05)；HvKP生物膜形成能力低于產ESBLsKP、MDRKP(P<0.05)；CRKP與HvKP比較，差異無統計學意義(P=0.802)；產ESBLsKP與MDRKP比較，差異無統計學意義(P=0.466)。見表2。

2.34種不同耐藥表型KP的RyhB基因擴增電泳結果分析 產ESBLsKP和MDRKP 存在特異性條帶(大小約200 bp)，CRKP 和HvKP不存在特異性條帶。qPCR擴增RyhB基因的陽性產物經測序后在NCBI數據庫進行比對分析，結果一致，大小為約200 bp，其中包含了完整的RyhB基因編碼區(91 bp)位于yhhY和虛擬蛋白ORF之間。見圖1。

2.4RyhB基因表達與KP生物膜形成能力關聯性分析 以生物膜形成能力為因變量，以組別與基因表達情況的交互項(共4項，其中以組別=MDRKP×RyhB基因表達=陽性為參照層級，其他層級均與此層級進行層內的比較，得出偏回歸系數β)，建立廣義線性回歸方程，偏回歸系數β用來表示關聯程度。對組別=CRKP×RyhB基因表達=陰性，檢驗P<0.05，說明此交互層級對生物膜形成能力的影響有統計學意義，β=-0.059，說明當組別為CRKP且基因表達陰性時，生物膜形成能力相對于參照層平均下降了0.059個單位，生物膜形成能力呈負向關聯；對組別=HvKP×RyhB基因表達=陰性，檢驗P<0.05，說明此交互層級對生物膜形成能力的影響有統計學意義，β=-0.057，說明當組別為HvKP且基因表達陰性時，生物膜形成能力相對于參照層平均下降了0.057個單位，與生物膜形成能力呈負向關聯；對組別=產ESBLsKP×RyhB基因表達=陽性，檢驗P>0.05，說明此交互層級對生物膜形成能力的影響無統計學意義。結果表明，在CRKP及HvKP菌株中，RyhB基因表達為陰性，其與其他組別基因表達為陽性比較，生物膜形成能力會下降；不同耐藥表型與RyhB基因表達的交互作用與生物膜形成能力有關(P<0.05)，且RyhB基因陰性表達時，會導致生物膜形成能力下降。見表3。

表2 4種不同耐藥表型KP生物膜形成能力多重比較

注：M泳道為DNA marker；1泳道為陰性對照；2泳道為陽性對照；3～5泳道為CRKP擴增條帶；6～10泳道為產ESBLsKP擴增條帶；11～14泳道為MDRKP擴增條帶；15～16泳道為HvKP擴增條帶。

表3 RyhB基因表達與KP生物膜形成能力的廣義線性模型

3 討 論

KP是呼吸道感染最常見的革蘭陰性條件致病菌，極易導致院內感染暴發。根據2018年中國細菌耐藥監測網結果顯示KP耐藥率呈逐年上升趨勢，特別是對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率從2005年的3.0%上升至2018年的27.6%，MDRKP和CRKP引起的抗感染治療成為臨床關注的焦點[12]。

細菌生物膜由多糖、蛋白質等組成，大量的黏性基質將細菌包裹，常規抗菌藥物往往難以穿透作用于該類細菌，導致臨床抗菌藥物治療效果差[13]。本研究收集的46株KP經過前期的工作，剔除來源同一患者的重復菌株及PFGE型別相似度>85%的菌株，相比盧鴻等[10]研究同一克隆菌株的KP生物膜形成能力更有臨床意義。彭蓉蓉等[14]研究表明KP生物膜的形成在ICU發生的概率較高，與本院臨床分布主要在ICU、呼吸科和神經外科的結果一致。本研究通過結晶紫染色法對4種不同耐藥表型KP生物膜形成能力進行定量檢測，結果顯示，4種KP均存在生物膜形成能力，其中產ESBLsKP、MDRKP的生物膜形成能力明顯強于CRKP和HvKP(P<0.05)。DAVIDO等[15]研究顯示，產ESBLsKP和MDRKP是目前醫院流行的主要致病菌，這表明生物膜形成能力是適應外界環境的重要方式，產ESBLsKP和MDRKP具有較強的生物膜形成能力，有利于其在醫院內定植及傳播，大量臨床分離菌株的出現與生物膜形成有密切關系。CRKP為4種不同耐藥表型中耐藥性最強的菌株，但是生物膜形成能力顯示5株CRKP為弱陽性、1株CRKP為中等陽性，這表明KP生物膜形成能力與耐藥性關系的具體機制仍有待進一步研究。

非編碼小RNA基因存在于絕大多數原核生物中，通常位于基因間區，具有特殊的莖環結構，可以被轉錄但不能被直接翻譯為蛋白，通過堿基反向互補調控靶標mRNA分子的表達[16]。細菌在不同溫度、營養、酸堿度、鐵離子濃度等條件下增殖并適應環境的能力依賴于蛋白質類的調控因子及一些非編碼小RNA的調控，RyhB最早是在大腸埃希菌中被發現，屬于非編碼小RNA[17]。腸桿菌科細菌除沙門菌和鼠疫耶爾森同時存在RyhB1和RyhB2外，絕大多數只有1個RyhB，研究表明，當鐵缺乏時RyhB通過下調細胞內非必需鐵蛋白的合成，RyhB本身的表達則受到負調控因子Fur的影響以維持體內鐵平衡[18]。KP的RyhB大小為91 bp，大腸埃希菌的RyhB大小為90 bp，兩者之間的同源性為92.3%，大腸埃希菌RyhB基因位于yhhX和yhhY之間，而KP的RyhB基因位于yhhY和虛擬蛋白ORF之間。目前美國臨床和實驗室標準協會還未制訂檢測KP生物膜形成的標準方法，尋找一種快速、靈敏度和特異度均高的可用于臨床標本檢測的方法，對生物膜相關性感染的治療和清除生物膜藥物的篩選有十分重要的臨床意義。本研究采用qPCR法擴增4種不同耐藥表型KP的RyhB基因，其中產ESBLsKP和MDRKP 存在特異性條帶，CRKP 和HvKP不存在特異性條帶，通過RyhB基因表達與KP生物膜形成能力的關聯性分析表明，RyhB基因是影響KP生物膜形成的重要調節因子之一。