硫化氫通過(guò)調(diào)控JNK通路改善H型高血壓大鼠心肌纖維化

李亞靈 劉茂軍 鄭霞 易嘉莉 宋熊 劉達(dá) 王森 楊軍

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421000)

高血壓是引起全球發(fā)病率和死亡率升高的主要原因之一，長(zhǎng)期處于壓力超負(fù)荷狀態(tài)下可導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大、凋亡、心肌纖維化，最終誘發(fā)心肌重構(gòu)和心力衰竭〔1〕。我國(guó)大約有75%高血壓患者同時(shí)合并高同型半胱氨酸血癥(HHCY)(血漿HHCY≥10 μmol/L)。原發(fā)性高血壓伴HHCY血癥通常被稱為“H型高血壓”，目前已發(fā)現(xiàn)H型高血壓患者心肌纖維化發(fā)生率與普通高血壓患者相比明顯升高〔2〕，但對(duì)其具體機(jī)制尚不明確。c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)通路可參與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，并與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)〔3〕。新近發(fā)現(xiàn)的第三種氣體信號(hào)分子H2S已被證實(shí)其可通過(guò)抗炎、抗氧化、抗凋亡的機(jī)制，發(fā)揮保護(hù)心血管的作用〔4〕，但對(duì)其是否能改善H型高血壓導(dǎo)致的心肌纖維化仍不是十分清楚。本文擬建立H型高血壓大鼠模型，觀察H2S對(duì)H型高血壓大鼠心肌纖維化的影響，并探討其機(jī)制是否與JNK信號(hào)通路，細(xì)胞凋亡有關(guān)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只雄性自發(fā)性高血壓(SHR)大鼠和20只同品系正常血壓對(duì)照成年雄性京都種(WKY)大鼠，均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，重(200±20)g，于(24±3)℃溫度的室內(nèi)飼養(yǎng)，自由取食及飲水，每12 h晝夜交替一次。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 兔源JNK、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-9等一抗及抗兔二抗均購(gòu)于Proteintech公司(美國(guó))，兔源GAPDH購(gòu)于博士德公司(中國(guó))；硫氫化鈉(NaHS)購(gòu)于Sigma 公司(美國(guó));茴香霉素(Anisomycin)和L-蛋氨酸等購(gòu)于美侖生物公司(中國(guó))；細(xì)胞裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)于碧云天公司(中國(guó))。

1.3模型制備 將SHR大鼠和WKY大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，其中 30只SHR大鼠飲用1%L-蛋氨酸建立H型高血壓模型后〔5,6〕隨機(jī)分為Model組10只，Model+H2S組10只，Anisomycin組10只。另20只WKY大鼠同樣條件普通飲水后隨機(jī)分為Control組10只，Control+H2S組10只。此外，Model+H2S組、Anisomycin組及Control+H2S組大鼠均給予NaHS〔56 μmol/(kg·d)〕腹腔注射，Anisomycin組大鼠在腹腔注射NaHS基礎(chǔ)上增加JNK的激動(dòng)劑Anisomycin〔5 mg/(kg·d)〕腹腔注射。Control組和Model組大鼠均使用同等劑量的生理鹽水腹腔注射，持續(xù)4 w。

1.4Masson 染色觀察心臟組織纖維化程度 取出固定于甲醛的心肌組織標(biāo)本，石蠟包埋，再脫水制成4 μm切片標(biāo)本，按Masson試劑盒進(jìn)行染色，光鏡下觀察心肌組織膠原纖維情況。

1.5Western印跡檢測(cè)心肌組織中JNK、Bcl2、Caspase-9蛋白的表達(dá) 在含有裂解液的緩沖液中提取總蛋白，然后使用 BCA 蛋白分析試劑盒定量。蛋白質(zhì)變性后，通過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，并通過(guò)濕轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在室溫下用含 5% 脫脂奶的 Tween-20 緩沖液(TBST)封閉 2 h。膜用含有一抗的封閉液孵育過(guò)夜(配比為：抗體GAPDH、Bcl2、Caspase-9,均為1∶1 000)，用TBST洗3次膜后，繼續(xù)孵育二抗(1∶5 000)室溫 1 h。接下來(lái)，膜在 TBST 緩沖液中清洗3次。最后，使用分子成像儀系統(tǒng)分析條帶。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS18.0軟件進(jìn)行Student-t檢驗(yàn)單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠心肌膠原的變化 Masson染色中鏡下觀察膠原纖維呈藍(lán)色。Model組、Anisomycin組大鼠肌絲排列不整齊，膠原纖維與Control組相比明顯增加(P<0.05)；Model+H2S組經(jīng)H2S供體干預(yù)后膠原沉積明顯減少(P<0.05)；H2S 組膠原沉積較Control組無(wú)明顯變化(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 H2S對(duì)大鼠心肌纖維化沉積的影響(Masson染色，×400)

2.2各組大鼠心肌組織中Bcl2、Caspase-9相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)水平 與Control組比較，Model組、Anisomycin組大鼠心肌組織中Caspase-9蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào) (P<0.05)；Bcl2蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)；與Model組比較，Model+H2S組，大鼠心肌組織中Caspase-9蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)；Bcl2蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào) (P<0.05)。H2S組和Control組大鼠心肌組織中Bcl2、Caspase-9蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2，表1。

1～5：Control組、Model組、Model+H2S組、Anisomycin組、H2S組，下圖同圖2 各組心肌組織中Bcl2、Caspase-9的表達(dá)水平

2.3各組大鼠心肌組織中JNK相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平 與Control組比較，Model組、Anisomycin組大鼠心肌組織中JNK蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)；與Model組比較，Model+H2S組，大鼠心肌組織中JNK蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)；H2S組和Control組大鼠心肌組織中JNK蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3，表1。

圖3 各組心肌組織中JNK的表達(dá)水平

表1 各組心肌組織中Bcl2、Caspase-9、JNK蛋白表達(dá)比較

3 討 論

研究報(bào)道，高血壓可導(dǎo)致心室僵硬度增加和心肌纖維化，誘發(fā)心肌重構(gòu)和心功能下降〔7〕，最終引發(fā)心血管死亡事件。在我國(guó)，75%高血壓人群合并HHCY血癥，有研究發(fā)現(xiàn)〔8〕，HCY可通過(guò)激活基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2誘發(fā)心肌纖維化，同時(shí)也有報(bào)道指出〔9〕，高HCY會(huì)加速壓力超負(fù)荷下心肌纖維化的進(jìn)展，導(dǎo)致心力衰竭等不良心血管事件的發(fā)生。本研究結(jié)果提示H型高血壓可導(dǎo)致明顯心肌纖維化。心肌纖維化是指心臟間質(zhì)重塑，并以心肌間質(zhì)成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖和膠原過(guò)度沉積為主要特征。Takemura等〔10〕發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與梗死后心肌重構(gòu)和心力衰竭密切相關(guān)。Yu等〔11〕也有類似發(fā)現(xiàn)，同樣該機(jī)制在其他心肌重構(gòu)模型中也得到證實(shí)。本研究結(jié)果提示細(xì)胞凋亡可能參與H型高血壓心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制。

JNK是三種促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的成員之一，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制〔12〕。Qi等〔13〕通過(guò)心肌缺血/再灌注模型發(fā)現(xiàn)JNK激活可通過(guò)下調(diào)Bcl2促進(jìn)細(xì)胞凋亡，也有研究證實(shí)〔14〕轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1可通過(guò)激活p38 MAPK-JNK-Caspase-9/8/3途徑誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果提示JNK信號(hào)通路的激活可能參與H型高血壓大鼠心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制。

作為第三種氣體信號(hào)分子，H2S已被證實(shí)可通過(guò)抗炎、抗凋亡、抗氧化的機(jī)制發(fā)揮保護(hù)心血管的作用〔14〕。已有研究證實(shí)H2S可改善高血壓誘導(dǎo)下心力衰竭小鼠的左心室重構(gòu)，并且能改善HHCYH9C2心肌細(xì)胞中MMPs失衡〔8〕。本研究結(jié)果提示H2S可通過(guò)激活JNK信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善H型高血壓大鼠心肌纖維化，但對(duì)其具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探討。