烏頭赤石脂丸方對急性心肌梗死大鼠血清炎癥因子及心肌CX43蛋白表達的影響

謝璐璐 郭軍鵬 張兆鵬 連春雨 肖鈺雪 史曉梅 王松 劉宏巖

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

急性心肌梗死(AMI)是由于冠狀動脈血流急性受阻、中斷導致相應的心肌嚴重缺血壞死，臨床癥狀危急，死亡率較高，容易引起心力衰竭。據《2018年中國心血管病報告》顯示〔1〕，AMI死亡率總體呈上升態勢，已經成為我國重大的公共衛生問題。近年來中醫藥在冠心病的防治上取得了良好的效果，但對AMI的防治還缺乏更加有效、方便、快捷的辦法。

中華中醫藥學會《胸痹心痛中醫診療指南》中明確指出胸痹心痛相當于西醫的冠心病心絞痛〔2〕。課題組前期實驗已證實烏頭赤石脂丸方可改善心肌缺血損傷的程度，減少心肌細胞的凋亡，并可改善心肌缺血再灌注造成的心肌損傷〔3～5〕?；谡n題組已研究的成果，本實驗旨在進一步探討烏頭赤石脂丸方對AMI大鼠心功能的保護作用及AMI與炎癥反應的關系。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級SD雄性大鼠，體重(260±20)g，購自長春億斯實驗動物技術有限公司，本實驗通過長春中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查批準。

1.2藥物 烏頭赤石脂丸方依據張仲景《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治第九》中原方原比例而定，烏頭選用川烏。方中蜀椒、川烏、干姜、附子、赤石脂比例為 2∶1∶1∶1∶2，中藥飲片均購自長春中醫藥大學附屬醫院中藥飲片房。本實驗在不改變藥物量效比例的前提下，易丸為湯，根據人服用藥量換算成大鼠給藥量，大鼠日用量為：蜀椒1.26 g、烏頭0.63 g、附子0.63 g、干姜0.63 g、赤石脂1.26 g，中劑量為臨床等效劑量，低、高劑量分別按中劑量1/3、3倍比例換算可得。煎煮方法：將川烏放入 10 倍體積水中浸泡 30 min，煎30 min，再與附子同煎 60 min后放入蜀椒、干姜、赤石脂(包煎)文火煎15 min，過濾湯液，后再加8倍體積的水文火煎煮15 min，過濾湯液，將2次煎煮的湯液混勻濃縮備用。

1.3試劑 蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號 G1120)。C反應蛋白(CRP)、白細胞介素(IL)-6、腦鈉肽(BNP)試劑盒(北京華英生物技術研究所)；心肌縫隙連接蛋白(CX)43蛋白抗體(美國 Proteintech 公司，批號：26980-1-AP)。

1.4儀器 BL-420S 型小動物生物機能實驗系統；HX-100E 型小動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)，CA-600 型全自動凝血分析儀(希森美康醫用電子有限公司)，生物顯微鏡(型號：Motic Panthera i)，奧林巴斯倒置熒光顯微鏡(型號：Dp80)。

1.5模型制備及分組給藥 將SPF級SD雄性大鼠適應性飼養1 w后，隨機分成正常組、模型組、烏頭赤石脂丸方低、中、高劑量組、尿激酶組，除正常組以外，其余組分別采用結扎冠狀動脈左前降支的方法制備AMI模型。術后第2天開始給藥治療，正常組常規飼養，模型組用等量生理鹽水灌胃，烏頭赤石脂丸治療組予烏頭赤石脂丸濃縮液，尿激酶組予以尿激酶2.5萬U/只腹腔注射。連續給藥7 d。

1.6心肌組織HE染色 取下的心肌組織用預冷生理鹽水進行清洗干凈，放入4%的多聚甲醛溶液中，于近心尖部的位置橫行切片，HE 染色，鏡檢照相。

1.7心肌組織免疫熒光染色 脫蠟和水化，抗原熱修復，內源性過氧化物酶滅活，封閉，一抗孵育，二抗孵育封片，熒光顯微鏡下觀察心肌組織CX43蛋白含量表達的情況。

1.8血清指標檢測及凝血四項指標的測定 腹主動脈采血6～8 ml，靜置30 min，離心機3 500 r/min離心15 min，取上清液，酶聯免疫吸附試驗檢測CRP、IL-6、BNP的含量；按照全自動凝血分析儀的操作流程進行操作，測定凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)和纖維蛋白原(Fbg)。

1.9統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1烏頭赤石脂丸方對AMI大鼠心電圖的影響 與正常組比較，模型組心電圖見心肌缺血改變，ST段弓背型顯著抬高。與模型組相比較，烏頭赤石脂湯各劑量組及尿激酶組心電圖均有ST段降低或病理性Q波。見圖1。

圖1 烏頭赤石脂丸方對急性AMI大鼠心電圖的影響

2.2烏頭赤石脂丸對AMI大鼠CRP、IL-6、BNP的影響 與正常組比較，模型組血清中CRP、IL-6、BNP含量顯著增加(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，烏頭赤石脂丸低、中、高劑量組血清中CRP、IL-6、BNP含量均顯著降低(P<0.01，P<0.05)，尿激酶組CRP、BNP顯著降低(P<0.05，P<0.01)，見表1。

2.3烏頭赤石脂丸對AMI大鼠凝血四項的影響 與模型組比較，烏頭赤石脂丸中、高劑量組PT、TT時間降低(P<0.05，P<0.01)，烏頭赤石脂丸低、中、高劑量組APTT時間降低(P<0.01)，Fbg含量減少(P<0.01)，差異均有統計學意義。見表1。

2.4烏頭赤石脂丸方對AMI大鼠心肌組織形態學的影響 正常組可見心肌細胞著色均勻，細胞核位于細胞中央，核大小及形態正常；模型組可見心肌纖維扭曲斷裂，肌絲排列疏松紊亂，細胞著色不均勻，部分細胞核固縮，心肌細胞數量減少，且有大量炎性細胞浸潤；烏頭赤石脂湯低、中、高劑量組及尿激酶組心肌形態均有不同程度的明顯改善，其中低劑量組心肌纖維仍有輕度扭曲，排列不整齊，炎性細胞散在分布的情況，中劑量組及高劑量組的心肌纖維排列趨于整齊，炎性細胞浸潤減輕，高劑量組心肌損傷改善明顯，與尿激酶組趨于相同，見圖2 。

圖2 烏頭赤石脂丸方對AMI大鼠心肌組織形態學的影響(HE，×400)

2.5烏頭赤石脂丸方對AMI大鼠心肌組織中CX43蛋白含量的影響 正常組心肌大量表達CX43蛋白(0.391±0.031)，表達產物為藍色熒光，在心肌中分布均勻；模型組CX43蛋白表達(0.304±0.012)明顯下降，分布不均勻，心肌纖維扭曲紊亂；烏頭赤石脂湯低、中、高劑量組心肌CX43表達(0.350±0.005、0.353±0.015、0.365±0.020)不同程度的上調，分布較為均勻，且心肌纖維排列整齊，中劑量組和高劑量組尤為明顯；尿激酶組心肌組織中CX43蛋白表達(0.328±0.022)增加，散在分布，心肌纖維排列較為整齊，見圖3。

圖3 免疫熒光染色觀察烏頭赤石脂丸方對AMI大鼠心肌組織中CX43蛋白含量的影響(×400)

3 討 論

早期的藥物溶栓是AMI發生后臨床首選的治療方案，以通過及時恢復冠狀動脈血流的方式來保護心肌細胞，減少心肌細胞的壞死，抑制心室重構的發生，延緩心功能惡化。AMI后心肌細胞的壞死促使了炎癥反應的發生，過度的炎癥反應則會擴大心肌缺血的范圍并造成心肌進一步的損傷，加劇了心室重構和心肌纖維化發展的進程，嚴重影響了患者的心功能，增加了發生心律失常、心力衰竭等的風險，降低了急性心血管病患者的生存率〔6〕。

有研究表明，心功能的惡化與AMI患者的血清炎性因子水平呈負相關，因此CRP、IL-6、BNP水平的升高提示了心肌損傷的程度，所以血清炎性因子的水平對判斷AMI的預后有十分重要的實際意義〔7,8〕?；诖?，本研究進一步探究了AMI后血清炎性因子的水平對心功能的影響。CRP是由肝臟分泌的炎癥反應蛋白，AMI時CRP升高且與AMI面積呈正相關。CRP作為炎癥反應常見的介質，在急性血栓形成過程中起到促進作用，是預測AMI發生的重要標志物〔9〕。炎癥反應是否進一步參與AMI的心室重構，影響AMI的預后已成為研究的新熱點。IL-6是一種單鏈糖蛋白細胞因子，是急性炎癥時由單核細胞等分泌的蛋白〔10〕。在機體抗感染的免疫反應中IL-6起到了十分重要的作用，是診斷急性感染早期的靈敏指標。BNP主要由心肌細胞合成分泌，是一種心臟神經類激素，主要反映心室肌的張力和心臟容量負荷的改變，也是反映機體心功能的重要因素〔11〕。急性心肌缺血能夠刺激腦鈉肽的分泌，且參與AMI的心室重構，嚴重心室重構則導致心力衰竭的發生，因此BNP的早期監測對于AMI預后有十分重要的意義。

烏頭赤石脂丸主要用于AMI等急性心血管疾病，主要病機為“陽微陰弦”，即上焦陽氣極虛、下焦陰寒痼結、痰飲閉阻心胸而發病。方中烏附為大辛大熱的藥物，實為峻逐陰寒、除濕化飲止痛之品，同用可急救于危難之時，迅速起效；蜀椒、干姜散其寒以振奮陽氣、調暢氣血，在一派大辛大熱的藥物之中，配伍赤石脂既可以收斂陽氣，也能固澀止血又可防止辛溫藥物發散太過?，F代藥理學研究表明，烏頭和附子具有抗心肌缺氧、抗凝血和抗心律失常等作用，附子還具有改善血液循環，促進血流量的作用，臨床研究中發現附子可抑制急性炎癥〔12〕。干姜主要的化學成分是揮發油，其中α-姜烯含量最高，具有解熱、抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集的作用，其中揮發油中所含的辛辣成分有改善局部血液循環的作用，實驗研究表明，干姜水煎劑可以通過調控AMI大鼠血清中炎癥因子的含量達到改善心肌缺氧的狀態目的?；诟阶訜o干姜不熱的理論基礎，研究表明附子與干姜的配伍可減少心肌細胞凋亡而保護心肌細胞〔13,14〕。蜀椒中主要含有的有效成分是揮發油，其中桉樹腦、4-萜品醇、D-檸檬油精、β-月桂烯、α-蒎烯含量較高，有研究表明蜀椒所含的揮發油對于急慢性炎癥有很好的抑制作用，且有一定的鎮痛作用〔15〕。烏頭赤石脂丸方諸藥合用才能更好地發揮溫陽散寒、祛寒止痛的功效。有臨床實踐證實，烏頭赤石脂湯可以改善老年缺血性心肌病，提高患者生活質量，其可能與降低血清中TNF-α、BNP的水平有關〔16〕。

綜上，烏頭赤石脂丸方可以顯著改善AMI大鼠模型的心功能，降低血清炎性因子CRP、IL-6的水平，有效地抑制心肌細胞凋亡；降低血清中BNP的含量，一定程度上抑制了心肌纖維化，延緩了心室重構的進程；可延長凝血酶原時間，降低纖維蛋白原的含量，改善了其血液黏度，防止血栓進一步形成而造成二次傷害；心肌細胞CX43蛋白表達有效增加，縫隙連接蛋白正常工作，減少心律失常和心力衰竭的發生，有效改善了心肌纖維化。