上調VEGF-B基因對慢性心力衰竭大鼠的作用及機制

陳磊 吳小燕 (海南醫學院第二附屬醫院心內科，海南 海口 570100)

慢性心力衰竭屬于心功能逐漸減退的病理過程，當心力衰竭出現后，心臟會在疾病的作用下導致引起心肌重構，進而導致心功能出現進行性的下降〔1〕。有研究表明〔2〕，慢性心力衰竭的基本病理機制為心肌重構，當心臟結構發生改變后，心肌舒張功能出現障礙，心排血量明顯不足，不能滿足機體所需要的代謝需求，其臨床表現為日常活動受限，伴隨著不同程度的呼吸困難，屬于多種心血管疾病的終末階段。血管內皮生長因子(VEGF)-B屬于VEGF家族中的成員，具有促血管生成、保護神經、供給機體營養的作用，并參與脂質代謝等生物學過程〔3〕。VEGF-B作為一種促進血管生成因子，具有促進心肌血管新生和促進心肌血管內皮的增殖的作用〔4〕。有研究表明〔5〕，低水平的VEGF-B和心臟疾病中發生心室重構、左心室功能有關。本研究觀察上調VEGF-B基因對慢性心力衰竭大鼠作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物：選取SPF級SD健康大鼠40只，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，鼠齡(3.9±0.6)個月，體重(225.8±11.5)g。所有大鼠養殖在干凈籠子里，室溫(22.1±1.8)℃，相對濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養時間1 w。本研究所做實驗均獲得醫院倫理委員會批準。

主要試劑：Lipofectmine 2000轉染試劑盒(購于北京義翹神州科技有限公司)，RPMI 1640培養基(購于武漢純度生物科技有限公司)，Ca試劑盒、CaN試劑盒(購于南京建成生物工程研究所)，小鼠抗大鼠NFAT3抗體、兔抗大鼠p-NFAT3抗體(購于Santa cruz公司)。

1.2方法

1.2.1基因轉染 取小鼠心肌細胞放置于RPMI 1640培養基中(含10%胎牛血清)、恒溫為37℃、含有體積分數為5%的CO2的培養箱中進行培養，當培養瓶中細胞融合率達到80%～90%時使用0.25%的胰酶消化，傳代。按照Lipofectmine 2000轉染試劑盒操作說明書對小鼠心肌細胞進行轉染，根據轉染物的不同將小鼠心肌細胞分為siRNA-VEGF-B(上調)細胞、siRNA-對照序列細胞。將轉染后的小鼠心肌細胞放置于恒溫為37℃、含有體積分數為5%的CO2的培養箱中進行培養，進行后續實驗。

1.2.2建模及分組 隨機選取40只小鼠中的10只作為對照組，另外30只小鼠建立參照Ahemed等〔6〕研究實驗中腹腔注射阿霉素的方法建立慢性心力衰竭大鼠模型，將阿霉素配制成2 mg/ml的溶液連續6 w注射于大鼠腹腔(4 mg/kg)，使用10%水合氯醛注射于大鼠腹腔進行麻醉處理，之后使得大鼠仰臥在操作臺上，并作固定，剃除大鼠胸前區毛發，測定心臟左心射血分數，當左心射血分數<60%時則表示慢性心力衰竭大鼠模型建立成功。將建模成功的30只慢性心力衰竭大鼠隨機分為模型組、上調組、下調組各10只。將轉染后的小鼠siRNA-VEGF-B(上調)心肌細胞、siRNA-對照序列(下調)心肌細胞分別注射于上調組、下調組小鼠心肌處，模型組和對照組不做任何處理。

1.2.3樣本采集 隨機選取各組中的7只大鼠采用斷頭法處死，立即取大鼠心肌組織，將提取的組織制作標本，使用40 ml/L的多聚甲醛進行固定，常溫下使用15%的乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，脫水后進行石蠟包埋，制作3 μm的組織切片，其中各組中的1份心肌組織樣本行病理組織學觀察，其中3份心肌組織剪碎放置于器皿中，之后將5 ml 25%的膠原酶Ⅱ加入，將心肌細胞分離出，剩余3份心肌組織樣本行后續指標檢測。

1.2.4病理組織學觀察 取各組中的1份心肌組織樣本行病理組織學觀察，進行蘇木素-伊紅(HE)染色處理后使用顯微鏡觀察病理變化。

1.2.5心功能測定 對各組剩余的3只大鼠心功能進行檢測，在檢測前稱量各大鼠體質量，并10%水合氯醛腹腔注射于大鼠腹腔進行麻醉處理(0.004 ml/kg)，仰臥位固定于實驗臺上。做氣管插管，行氣管插管并連接小動物呼吸機，將右頸外動脈分離后行結扎處理，結扎所分離出的右頸外動脈遠心端，使用動脈夾對大鼠動脈近心端夾閉，并在動脈壁剪以小口，將帶有肝素的靜脈穿刺套管針逆行刺入，并慢慢將穿刺針退出，緩慢將導管推進左心室，之后將穿刺套管核和壓力換能器相連接，將BL-420S生物信號采集和分析系統接入，記錄四組大鼠左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張壓(LVEDP)、左心室內壓力上升的最大速率(+dp/dt)、左心室內壓力下降的最大速率(-dp/dt)及心率變化。

1.2.6心室重構參數測定 在大鼠完成上述心功能測定后將3 ml 10%氯化鉀液注射于靜脈中，促使大鼠心臟在舒張末期停止搏動，之后迅速打開大鼠胸腔，將心臟取出，使用冷勝利鹽水沖洗，之后將心臟外結締組織、大血管及心房取出，將右心室沿著室間隔剪去，使用濾紙吸干后對左心室質量(LVAM)進行稱取，計算左心室質量指數(LVMI)，LVMI=LVMI/大鼠體重，使用直接測量法計算大鼠左心室短軸、長軸長度，計算球形指數(SI)，SI=左心室長軸長度/左心室短軸長度。

1.2.7心肌細胞中Ca2+濃度檢測 將所分離出的心肌細胞放置于溫度為37℃水中行水浴處理，之后使用Fluo/AM避光孵育，孵育時間為1 h，之后在轉速為3 000 r/min的離心機中離心處理1 min，去除負載液，并使用生理記錄液反復洗滌3次。使用激光共聚焦顯微鏡對形態完成、染色效果較好的細胞進行掃描，心肌細胞中熒光值(鈣離子濃度)測定：激發波長為488 nm、發射波長為520 nm。之后使用計算機將圖像處理，得到細胞內分布圖。最后經過系統分析、換算出心肌細胞中Ca2+濃度。

1.2.8心肌組織中鈣調神經磷酸酶(CaN)活性、T細胞活化因子(NFAT)3、磷酸化(p)-NFAT3蛋白檢測 使用酶學比色法檢測四組大鼠心肌組織中CaN活性，使用Western印跡檢測四組大鼠心肌組織中NFAT3、p-NFAT3蛋白表達量。

1.3統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1各組病理組織學觀察 如圖1所示，對照組大鼠心肌細胞排列整齊、橫縱紋較為清晰，細胞核形態、大小正常，心肌細胞間質無纖維細胞增生。模型組大鼠心肌細胞排列混亂，間隙腫脹、增寬，心肌纖維缺損，細胞核呈現為圓形，細胞質不均勻。下調組大鼠心肌細胞排列混亂呈現為波浪狀，無橫縱紋，細胞核固縮，細胞質不均勻，心肌細胞間質出現炎細胞浸潤現象，心肌纖維缺損、斷裂。上調組大鼠心肌細胞排列整齊，可見有橫縱紋，存在輕度的心肌纖維顆粒狀變性，且存在缺損、斷裂，細胞核呈現為圓形。

圖1 各組大鼠病理組織學觀察(HE，×100)

2.2各組大鼠心功能指標變化比較 與對照組相比，模型組、下調組、上調組大鼠LVSP、+dp/dt、-dp/dt均明顯降低，LVEDP、心率均明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，下調組大鼠LVSP、+dp/dt、-dp/dt均明顯降低，LVEDP、心率均升高，上調組大鼠LVSP、+dp/dt、-dp/dt均明顯升高，LVEDP、心率均明顯降低(均P<0.05)；與下調組大鼠相比，上調組大鼠LVSP、+dp/dt、-dp/dt均明顯升高，LVEDP、心率均明顯降低(均P<0.05)。見表1。

2.3各組大鼠心室重構情況比較 與對照組相比，模型組、下調組、上調組大鼠LVAM、LVMI均明顯增大，SI均明顯縮小(P<0.05)；與模型組相比，下調組大鼠LVAM、LVMI明顯增大，SI明顯縮小，下調組大鼠LVAM、LVMI明顯增大，SI明顯縮小(均P<0.05)；與下調組相比，上調組大鼠LVAM、LVMI明顯縮小，SI明顯增大(均P<0.05)。見表2。

2.4各組大鼠心肌細胞中Ca2+濃度、心肌組織中CaN活性、NFAT3、p-NFAT3蛋白變化比較 與對照組相比，模型組、下調組、上調組大鼠心肌細胞中Ca2+濃度、心肌組織中CaN活性、NFAT3、p-NFAT3蛋白表達量均明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，下調組大鼠心肌細胞中Ca2+濃度、心肌組織中CaN活性、NFAT3、p-NFAT3蛋白表達量均明顯升高，上調組大鼠心肌細胞中Ca2+濃度、心肌組織中CaN活性、NFAT3、p-NFAT3蛋白表達量均明顯降低(均P<0.05)；與下調組相比，上調組大鼠心肌細胞中Ca2+濃度、心肌組織中CaN活性、NFAT3、p-NFAT3蛋白表達量均明顯降低(均P<0.05)。見表3、圖2。

表2 各組大鼠心室重構情況比較

組別Ca2+濃度(nmol/L)CaN(U/mg蛋白)NFAT3p-NFAT3對照組79.56±5.455.62±0.340.25±0.090.18±0.01模型組149.56±15.261)12.45±2.251)0.89±0.121)0.65±0.051)下調組169.56±20.141)2)15.24±3.121)2)0.96±0.101)2)0.73±0.101)2)上調組100.24±7.621)2)3)7.23±0.981)2)3)0.69±0.011)2)3)0.45±0.091)2)3)F/P值5.735/0.0014.032/0.00112.624/0.0017.747/0.001

圖2 Western印跡檢測心肌組織中NFAT3、p-NFAT3蛋白

3 討 論

慢性心力衰竭的發生可導致心功能、心臟結構發生異常，且多數患者均伴隨著神經體液變化和血流動力學的改變，最終導致動脈血液灌注不足、靜脈淤血等〔7〕。目前隨著我國老齡化現象的日益加重，多種心血管疾病的發病率逐漸升高，慢性心力衰竭的發病率隨之升高，嚴重威脅著人類的生命安全，因此防治慢性心力衰竭對降低疾病發病率和死亡率尤為重要〔8〕。

VEGF-B在臨床上一直被認為是血管內皮因子家族中的具有多種生物學功能的多條，能對血管外基質講解、細胞遷移、細胞黏附等具有調節作用，對內皮祖細胞向血管內皮細胞分化、內皮細胞分化成管腔具有調節作用，為血管的再生提供了有利條件〔9，10〕。微血管灌注重要組成部分為心肌血管再生，可促進心臟修復和改善心室重構〔11〕。VEGF-B能夠促進心肌血管內皮增殖，對血管再生具有調節作用，可對受損的心肌細胞具有修復作用〔12〕。目前有研究表明，在患有心臟疾病的患者中，其血清中VEGF-B水平顯著低于健康人〔13〕。本研究結果提示，上調VEGF-B基因可在一定程度上改善慢性心力衰竭大鼠心功能和心室重構，促進大鼠心臟功能的恢復。

慢性心力衰竭的發生與心肌重構的發生有關，有研究表明〔14～16〕，Ca2+-CaN-NFAT3信號通路參與多種原因所導致的心肌重構、心力衰竭、心肌肥大等發展過程，并在上述病理過程中有著重要的意義。心肌重構是慢性心力衰竭發生的病理基礎，在其發生發展過程中CaN作為起始信號傳導系統，活化T細胞核因子屬于CaN作用的下游靶點，而NFAT3屬于CaN下游靶點所調控的蛋白，在CaN所介導的心肌重構中具有重要的作用〔17～19〕。Ca2+屬于一種細胞內信號傳導信使，進而CaN所介導的心肌重構信號通路有關，當心肌細胞中的Ca2+濃度升高后會將CaN激活，促進p-NFAT3失去磷酸化作用，當p-NFAT3去磷酸化后會進入細胞核，誘導多種和換心肌細胞相關基因的異常表達，最終引發心肌重構的發生，最終導致心力衰竭的發生〔20〕。本研究結果說明上調VEGF-B基因可在一定程度上改善慢性心力衰竭大鼠心功能和心室重構，促進大鼠心臟功能的恢復機制可能與上調VEGF-B基因后通過作用于Ca2+-CaN-NFAT3信號通路，降低心肌細胞中Ca2+濃度，使得心肌組織中CaN失活，調控NFAT3、p-NFAT3蛋白表達有關。但目前臨床上對于VEGF-B基因與Ca2+-CaN-NFAT3信號通路、慢性心力衰竭之間的聯系并無研究，因此本研究結果還需后續實驗進一步研究證實。