lncRNA-UCA1通過調(diào)節(jié)TGFβ1對海人酸誘導(dǎo)小鼠癲癇的保護作用

楊誠 羅濤 彭夏培 肖敏 傅曼

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢 430014)

癲癇患者常表現(xiàn)為反復(fù)、突然抽搐、感覺、意識或精神等異常。長期、頻繁或嚴重的癲癇發(fā)作會導(dǎo)致進一步的腦損傷甚至持久性的神經(jīng)精神障礙〔1〕。癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)可導(dǎo)致急性和持久的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及海馬神經(jīng)元損傷。SE的急性期后，缺血、缺氧、水腫和炎癥反應(yīng)會發(fā)生在海馬區(qū)，包括誘導(dǎo)興奮性氨基酸的釋放，大量鈉離子和鈣離子等相關(guān)機制的變化，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷(包括海馬神經(jīng)元丟失，神經(jīng)細胞凋亡、膠質(zhì)細胞增殖、苔蘚纖維發(fā)芽、海馬硬化等)，這就是慢性自發(fā)性癲癇發(fā)生和發(fā)展的主要原因。最后就逐漸形成難治性的顳葉癲癇〔2〕。顳葉癲癇發(fā)病率占所有癲癇的25%，臨床上針對該種癲癇類型病人的多種抗癲癇藥物的療效并不理想〔3〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β1的激活可以通過膠質(zhì)細胞有效率地引起廣泛的基因表達和調(diào)節(jié)細胞因子的目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，在炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用來保護神經(jīng)元的損傷〔4〕。雖然很少有文獻報道癲癇發(fā)作伴隨著TGFβ1在大腦中的表達減少，從而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡和激活的膠質(zhì)細胞，并促進癲癇小鼠的腦部病變，但有相關(guān)報道〔5〕講述了癲癇中與TGFβ1相關(guān)的調(diào)節(jié)機制。長鏈非編碼RNA(lncRNA)通常分為基因間lncRNA、基因內(nèi)RNA、競爭內(nèi)源性RNA，高度保守的轉(zhuǎn)錄區(qū)域和反義RNA等〔6〕。與可以編碼蛋白質(zhì)的RNA相比，lncRNA具有更短的長度、更少的外顯子、更弱的編碼能力及組織細胞特異性；與mRNA相比，lncRNA在相近的物種中具有更低的保守性〔7〕。研究〔8〕發(fā)現(xiàn)，lncRNA的表達有組織特異性，與大腦發(fā)育、神經(jīng)元分化和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等密切相關(guān)，例如神經(jīng)退行性疾病、腦缺血、膠質(zhì)瘤與癲癇。尿道上皮癌相關(guān)(UCA)1是一個lncRNA，已知在膀胱癌中表達上調(diào)。UCA1被認為在胚胎發(fā)育與腫瘤侵入及增殖中起到調(diào)控作用，它參與調(diào)控腫瘤發(fā)生和胚胎發(fā)育中的好幾個基因〔9〕。已有研究〔10〕發(fā)現(xiàn)，在海馬移除手術(shù)的顳葉癲癇病人中UCA1展現(xiàn)出異常的甲基化，但是它導(dǎo)致癲癇發(fā)作的可能機制沒有進一步研究。本研究旨在探討lncRNA-UCA1通過調(diào)節(jié)TGFβ1對海人酸誘導(dǎo)小鼠癲癇的保護作用。

1 材料和方法

1.1實驗動物癲癇造模及評級標(biāo)準(zhǔn) 實驗材料：C57/B6健康小鼠90只，鼠齡4～6個月，體重160～280 g，由武漢中心醫(yī)院提供。隨機分為對照組30只和實驗組60只。動物飼養(yǎng)：C57/B6小鼠(10～12 w)飼養(yǎng)于(23±2)℃，12 h白光/12 h黑暗交替的IVC動物房，自由飲食/進水。

模型制備：實驗組腹腔注射海人酸20 mg/kg后即連續(xù)觀察5 h小鼠行為變化。當(dāng)小鼠持續(xù)癲癇性發(fā)作達1 h給予地西泮4 mg/kg腹腔注射，如不能緩解癲癇性發(fā)作，可重復(fù)給予地西泮一兩次，直到癲癇性發(fā)作被解除。對照組以35 μl/g生理鹽水取代海人酸，其余用藥、步驟及方法與實驗組相同。分別在建模成功后第1、7、14、30、60天處死小鼠，然后根據(jù)實驗情況隨機選擇小鼠進行實驗。

1.2免疫熒光染色 小鼠灌流取腦組織蔗糖梯度脫水后利用冰凍切片切冠30 μm，先用1×磷酸鹽緩沖液(PBS)在搖床上清洗腦片，5 min一次洗3次；利用0.5%Triton in PBS破膜，室溫孵育30 min；利用3%胎牛血清封閉，室溫封閉1 h；孵育c-Fos一抗(ab190289，1∶200，abcam)，4℃過夜孵育12 h；利用1×PBS清洗腦片，5 min一次洗3次；孵育熒光二抗(A10040，1∶200，invitrogen)，室溫孵育1 h，最后孵育4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)(1∶500)5 min，清洗貼片。

1.3qRT-PCR 采用Trizol(Invitrogen)法提取總RNA，并使用分光光度計測濃度和純度,使用FSQ-301 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remove試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，用于UCA1和TGFβ1的檢測。按說明使用SYBRs GREEN PCR Master Mix(Applied Biosystems)配置預(yù)混液，在ABI7500 qRT-PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)R擴增，采用ΔΔCT 法分析。以GAPDH為UCA1和TGFβ1的內(nèi)參。

UCA1正向引物：5′-ACCTCA ACCCAAAGGCAG-3′；反向引物：5′-GCCTTTGTGCCGCTACTTTT-3′；TGFβ1 正向引物：5′-CCTCGTCATCTGTCTCGCAT-3′；TGFβ1 引向引物：5′-AGTCGTCCGTCTGTAGTGAT-3′；GAPDH正向引物：5′-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3′；反向引物:5′-TGTATCCAAAC TCATTGTCATAC-3′。

1.4立體定位注射 麻醉：5%水合氯醛，腹腔緩慢注射，210 mg/kg，隨時注意動物狀態(tài)。頭部固定：將小鼠的門齒固定于腦定位儀上頜固定器，然后把一側(cè)的耳捧推入動物的外耳道后，使動物的頭在處于兩滑道正中。再將另一耳捧推入另一側(cè)的外耳道。這時觀察兩個耳棒的刻度一致后，將兩耳棒上的固定螺絲扭緊，在將牙齒固定器上壓鼻環(huán)壓下后扭緊，這時從各個方向推壓動物頭部均不會出現(xiàn)移動。開顱鉆孔前的備皮：剪去動物頭部毛，用2% 碘酒及75% 酒精棉球作頭部皮膚的消毒，沿矢狀縫做一約0.8 cm長的皮膚切口，分離皮下組織，用雙氧水清潔顱骨表面的筋膜及肌肉并剝離，推開骨膜，暴露前囟、人字縫及矢狀縫。確定標(biāo)準(zhǔn)中線：將金屬定位針向下移動到矢狀縫上方后，再前后移動定位針，確保矢狀縫在一條直線上；使定位針定位到前囟，然后移動到后囟，保證前后囟的高度一致。海馬DG定位：用定位針在前囟后2.1 mm,矢狀縫旁開1.3 mm處定位一點，即為海馬的平面位置，然后在此點上用鉆孔針在顱骨上鉆一小圓孔。小鼠海馬DG則位于該圓孔下2 mm。注射病毒(LV-U6-shUCA1，Genechem)：將微量注射器吸入病毒后，安置到微量注射泵上，使注射器針頭由小鼠腦鉆孔處下降2 mm時，開始病毒注射。注射速度：50 nl/min。注射劑量：2 μl/DG。留針：注射完成后，原位置留針5 min，然后上移1 mm，繼續(xù)留針5 min，拔針。縫皮：2% 碘酒及75% 酒精棉球作頭部皮膚的消毒后，縫皮。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進行方差分析、t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1小鼠癲癇發(fā)作分級 癲癇性發(fā)作按Racine分級標(biāo)準(zhǔn)進行判定：0級，無抽搐發(fā)作；Ⅰ級，耳、面部抽搐；Ⅱ級，肌陣攣，但無直立位；Ⅲ級，肌陣攣，伴直立位；Ⅳ級，全身強直陣攣發(fā)作；Ⅴ級，強直陣攣發(fā)作，并失去體位控制。以出現(xiàn)持續(xù)1 h的Ⅲ級以上的發(fā)作，并在解除癇性發(fā)作后狀態(tài)良好的小鼠為癲癇持續(xù)狀態(tài)模型成功鼠。實驗組均為癇性發(fā)作，經(jīng)處理后呈持續(xù)性Ⅲ～Ⅳ級發(fā)作，其中56只經(jīng)地西泮處理后緩解，為癲癇持續(xù)狀態(tài)模型成功鼠，成功率為93.33%(56/60)。實驗組海馬區(qū)c-Fos染色表明海人酸腹腔注射誘導(dǎo)癲癇模型中及早基因c-Fos主要表達在小鼠大腦海馬的DG區(qū)(圖1、2)。

2.2UCA1與TGFβ1在癲癇不同時間點均表達上調(diào) 癲癇造模后取不同時間點(1、7、14、30、60 d)小鼠海馬組織提RNA進行qRT-PCR檢測UCA1與TGFβ1的表達情況。將對照組表達量全部均化為1之后，實驗組1 d UCA1相對表達水平(4.831 3±0.072 1)，7 d(6.751 8±0.114 3)，14 d(12.642 5±1.007 8)，30 d(4.765 9±0.069 6)，60 d(2.433 1±0.070 2)均明顯上升(P<0.01);實驗組1 d TGFβ1相對表達水平(0.682 5±0.010 8)，7 d(0.753 8±0.080 3)，14 d( 0.344 2±0.015 7)，30 d(0.160 9±0.008 6)，60 d(0.357 1±0.009 3)均明顯下降(n=3，均P<0.01)。

圖1 癲癇造模后c-Fos免疫熒光染色(×2)

圖2 實驗組小鼠腦組織海馬區(qū)放大c-Fos熒光染色結(jié)果(×2)

2.3沉默UCA1的表達下調(diào)TGFβ1并緩解癲癇發(fā)作等級 進一步設(shè)計UCA1的shRNA并包裝成慢病毒注射到小鼠海馬DG區(qū)，3 w后取小鼠海馬組織提取RNA做qRT-PCR檢測TGFβ1的表達發(fā)現(xiàn)，病毒注射實驗組TGFβ1的表達(2.275 9±0.231 2，P<0.01)較對照組(0.987 3±0.004 5)顯著升高(n=4，P<0.01)。將病毒注射組3 w后與正常老鼠同時進行海人酸癲癇造模，結(jié)果顯示實驗組成功率〔43.33%(13/30)〕較對照組〔83.33%(25/30)〕顯著降低(n=30，均P<0.01)。

3 討 論

TGFβ1通過細胞表面的受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控者細胞的增殖、分化、黏附、轉(zhuǎn)移和凋亡。它參與了多種不同疾病的發(fā)生與發(fā)展，在神經(jīng)系統(tǒng)中與許多生理病理過程相關(guān)，并發(fā)揮著神經(jīng)保護作用。TGFβ1廣泛存在于靜息狀態(tài)細胞的細胞質(zhì)中。當(dāng)細胞受到環(huán)境的刺激時，特異的抑制性蛋白抑制劑IkB可以被磷酸化和滅活，所以TGFβ1被激活入核；然后TGFβ1 結(jié)合到細胞核內(nèi)的一些增強子基因的元件GGGRNNYYCC，開始啟動或調(diào)節(jié)早期反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄及參與炎癥反應(yīng)、細胞增殖和細胞凋亡〔11〕。癲癇是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，TGFβ1可能通過作用于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞等及經(jīng)由多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響癲癇的形成和發(fā)展。之前有研究〔12〕癲癇發(fā)作后海馬的炎癥與免疫反應(yīng)時發(fā)現(xiàn)，長時間的癲癇發(fā)作導(dǎo)致TGFβ1失活的標(biāo)志就是TGFβ1的表達減少，癲癇發(fā)作引起的炎癥級聯(lián)反應(yīng)可能會導(dǎo)致TGFβ1在星形膠質(zhì)中過表達。鑒于TGFβ1激活癲癇的發(fā)病機制的復(fù)雜性，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點之一。大量研究〔13，14〕顯示，lncRNA在大腦中豐富表達，參與調(diào)控大腦發(fā)育，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。近年發(fā)現(xiàn)〔15〕成年小鼠腦中有849個lncRNA參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，lncRNA同樣可以參與癲癇的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果表明，UCA1和TGFβ1的表達水平隨時間的變化是成負相關(guān)的，由此可以推斷UCA1和TGFβ1之間存在著調(diào)控作用。本實驗結(jié)果表明UCA1在海人酸誘導(dǎo)小鼠癲癇中通過與TGFβ1的相互作用來誘發(fā)或者加劇癲癇癥狀，通過抑制UCA1的表達可以上調(diào)TGFβ1進而抑制緩解癲癇發(fā)作。