哮喘大鼠支氣管高反應性與氣道重塑的相關性

王心曉 歐宗興 齊見旭 (中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院呼吸內科，海南 海口 570208)

哮喘是一種以氣道炎癥、可逆性氣流受限和支氣管高反應性為特征的下呼吸道慢性疾病〔1〕。隨著哮喘病程的延長，嗜酸粒細胞浸潤等因素會引起氣道重塑，包括上皮緊密連接缺失、上皮杯狀細胞化生、網狀基底膜增厚(RBM)和氣道平滑肌(ASM)的肥大和增生〔2〕。目前評估哮喘患者病情的方法包括支氣管激發試驗測定支氣管高反應性、肺功能檢查及氣道炎癥指標(嗜酸性粒細胞和一氧化氮等)檢測〔3〕。研究雖已表明氣道重塑與肺功能下降相關〔4〕，但對于支氣管高反應性與氣道重塑之間的關系及在哮喘病程中所扮演的角色尚不清楚，為此本研究通過建立哮喘模型大鼠探討哮喘大鼠支氣管對組胺的高反應性與氣道重塑和哮喘病程的相關性。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級雄性SD大鼠20只，4～6周齡，體重200～220 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，經過適應性喂養后，分成對照組10只和哮喘組10只。

1.2動物建模 哮喘組建模過程參照既往已發表相關文獻〔5〕，分為致敏和激發兩個階段。具體為：①致敏階段，哮喘組大鼠在第1天和第8天，腹腔注射含氫氧化鋁(上海源生科技)100 mg，卵蛋白(上海源生科技)100 mg的現配溶液1 ml。②激發階段：從第15天用1%卵蛋白液霧化吸入刺激，每次時間約30 min，隔天1次，共霧化8 w。當大鼠出現口唇發紺、氣促、抽搐、站立不穩等表現時候，表示模型建立成功。對照組大鼠致敏和激發兩個階段均使用生理鹽水，方法同模型組。本研究符合動物實驗倫理準則，并獲得大學動物倫理委員會的許可。

1.3肺功能檢查和支氣管激發試驗 應用小動物肺功能儀(加拿大 SCIREQ公司)測量兩組大鼠肺功能情況，記錄數值包括第1秒用力肺活量(FEV1)、肺活量(VC)、呼氣流量峰值(PEF)和最大呼氣中期流量(MMEF)。哮喘組行支氣管激發試驗測定氣道對乙酰膽堿(Ach)和組胺(Hist)的反應性：分別讓大鼠吸入0.157、0.316、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000和20.000 mg/ml的氯化乙酰膽堿溶液(上海聯碩生物科技有限公司)和0.078、0.157、0.316、0.625、1.250、2.500、5.000和10.000 mg/ml的磷酸組織胺溶液(上海聯碩生物科技有限公司)，每次吸入后，用肺功能儀測量FEV1。通過定量霧化吸入器吸入上述藥物，持續時間為1 min，濃度從低到高，直至出現陽性結果。根據吸入的Ach或Hist的對數濃度，繪制出相應曲線，計算FEV1下降百分比。支氣管高反應性的定義為吸入激發劑后，FEV1降低20%，PC20即為引起FEV1下降20%的激發劑濃度，分別記錄PC20-Ach 和PC20-Hist數值。試驗結束時，讓大鼠吸入沙丁胺醇氣霧劑(上海聯碩生物科技有限公司) 200 μg恢復初始氣道狀態。

1.4標本采集和處理 兩組大鼠于末次吸入后的24 h內用1 ml 1%的戊巴比妥進行腹腔注射麻醉，之后從右肺上葉和下葉支氣管取2～3個支氣管標本。

1.5RBM和ASM厚度的測量 支氣管標本在10%甲醛中固定，包埋在石蠟中，切割3 mm，用蘇木素-伊紅(HE)染色。從2個不同活檢標本的5個切片中測定支氣管上皮底部到網狀層外邊界的厚度即為RBM厚度；在至少5個切片中測量穿過細胞核的ASM細胞的直徑大小即為ASM厚度。所有厚度的評估全部由圖像分析軟件Image Pro Plus 5.0完成。

1.6統計學方法 應用SPSS25.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1兩組大鼠支氣管組織病理形態學改變 對照組大鼠支氣管管壁結構完整，無炎細胞浸潤現象；哮喘組大鼠支氣管壁可見大量的炎細胞浸潤，以中性粒細胞和嗜酸性粒細胞為主，支氣管管壁結構錯亂，氣管壁和周圍大量炎細胞浸潤，氣管壁明顯增厚，平滑肌肥大，管腔狹窄明顯。見圖1。

圖1 兩組支氣管病理形態學改變(HE，×100)

2.2兩組支氣管重塑指標比較 哮喘組RBM厚度〔(8.94±0.68)μm vs (4.02±0.75) μm〕、ASM厚度〔(9.27±0.46)μm vs (4.43±0.54) μm〕和支氣管嗜酸性粒細胞浸潤數〔(0.69±0.11)個/mm2vs (0.11±0.03)個/mm2〕均顯著高于對照組(P<0.05)。

2.3哮喘與肺功能、支氣管高反應性和氣道重塑的關系 哮喘與ASM呈顯著正相關(r=0.48，P<0.05)，與肺功能指標FEV1(r=-0.37)、PEF(r=-0.53)和MMEF(r=-0.35)及支氣管激發試驗指標PC20-Hist(r=-0.43)呈顯著負相關(P<0.05,P<0.001)；但與PC20-Ach(r=-0.28)及RBM(r=0.27)無顯著相關性(P>0.05)。

2.4影響ASM厚度的相關因素 ASM厚度與PC20-Hist呈顯著負相關(r=-0.39，P<0.01)，但與FEV1(r=-0.15)、PEF(r=-0.20)、MMEF(r=-0.26)和PC20-Ach(r=-0.23)無顯著相關性(P>0.05)。

3 討 論

支氣管高反應性是氣道對各種刺激因子的反應性異常增強，使得氣道過強或過早的收縮致氣管擴張效應喪失，是哮喘重要的發病機制之一〔6〕。哮喘患者的氣道平滑肌細胞在縮氣管刺激減弱時，仍有維持收縮的能力，導致固定性的氣流受限。隨著哮喘的反復發作和病程的遷延，氣道壁會重復損傷和修復這一過程，而氣道壁的結構也在此過程中逐漸發生改變即氣道重塑，表現為平滑肌細胞的肥大、基底膜的增厚和上皮下纖維化等特征〔7〕。

本研究納入的哮喘大鼠和對照大鼠比較體現了哮喘的致敏狀態和嗜酸性粒細胞浸潤的特點。嗜酸性粒細胞作為過敏性炎癥反應的特征性細胞，在哮喘的氣道重塑和氣道炎癥中扮演著重要角色〔8〕，一方面嗜酸性粒細胞釋放過敏介質，使得氣道血管通透性增加，氣道分泌物和滲出物增多；另一方面，嗜酸性粒細胞產生轉化生長因子β，也誘導氣道平滑肌細胞的肥大和杯狀細胞的增殖〔9〕。支氣管活檢結果表明哮喘大鼠發生了明顯的氣道重塑，引起了平滑肌的增生和基底膜的增厚。ASM和RBM的測定是評價氣道是否發生重塑及氣道重塑嚴重程度的關鍵指標〔10〕，這是因為ASM細胞是支氣管內的主要結構細胞，隨著哮喘的進展，ASM細胞不斷增生肥大，并會分泌和沉積大量的細胞外基質，使得RBM增厚，引起氣道壁的不可逆改變。此外，ASM細胞通過表達細胞黏附因子、趨化因子等參與炎癥和重塑過程〔11〕。

本研究通過相關性分析顯示哮喘病程越長，肺功能越差，這是因為雖然哮喘在早期是可逆的氣流受限，但隨著病程的遷延和反復，氣道壁逐漸發生重塑，肺部結構改變，可逆性的氣流受限轉化為了固定受限，肺功能也逐漸下降〔12〕。相比RBM，ASM在評估哮喘病程和代表氣道重塑方面具有更重要的臨床意義。在氣道高反應性指標方面，哮喘大鼠對于組胺的刺激相比乙酰膽堿更加敏感，激發試驗的成功率也會更高〔13〕。本研究結果提示臨床上對于哮喘患者氣道反應性的評估，應用組胺作為激發劑敏感性更強，應優先選擇組胺進行激發試驗；而對哮喘氣道重塑的檢查與嚴重程度的評價，ASM應該作為首選指標。這也與國外相關研究結果相一致〔14，15〕，組胺引起的氣道高反應性在哮喘的病理生理機制中扮演著關鍵角色，是引起ASM肥大和氣道重塑的直接原因〔16，17〕，而針對組胺信號通路的抑制則可以顯著改善氣道平滑肌的異常收縮問題，這也為未來哮喘治療的新靶點提供了方向〔18〕。

綜上，哮喘大鼠有顯著氣道重塑現象，表現為RBM的增厚ASM的肥大；氣道重塑與支氣管對組胺的高反應性顯著相關，且二者是哮喘病程的重要預測因素。