葛根素通過下調miR-196a-3p促進大鼠成骨細胞增殖和分化的機制

王海珍 王麗娟 贠云飛

(1唐山市協和醫院中醫科，河北 唐山 063000；2唐山市遷西縣人民醫院骨科)

骨質疏松是一組以骨量減少、骨微結構退化為主要特點的代謝性骨病變，患者多伴有腰背痛且骨脆性增加極易發生骨折，嚴重影響患者生活質量〔1〕。成骨細胞是調節骨形成和骨重建過程的重要功能性細胞，能特異性分泌多種生物活性物質，促進骨基質形成和骨組織礦化，是預防和治療骨質疏松的重要靶點〔2，3〕。葛根素是從中藥葛根中提取的單體成分，具有雌激素樣作用，對成骨細胞增殖和分化具有促進作用〔4，5〕。但目前葛根素促進成骨細胞增殖、分化的具體機制還不清楚。miRNA是一類內源性非編碼小分子RNA，通過調節靶基因轉錄后表達影響多種生物學過程，包括細胞增殖、分化和凋亡等〔6〕。相關研究報道〔7〕，miR-196a-3p能夠調控骨質疏松易感基因的單核苷酸多態性(SNP)功能位點，與骨礦物質密度有關，提示miR-196a-3p可能在骨質疏松發病中發揮潛在作用。本研究以大鼠成骨細胞CP-R091為研究對象，觀察miR-196a-3p和不同濃度葛根素對成骨細胞增殖和分化的影響，并探討葛根素影響miR-196a-3p表達促進大鼠成骨細胞增殖和分化的潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1細胞株和主要試劑 大鼠成骨細胞CP-R091(武漢普諾賽生命科技有限公司)；葛根素(中國藥品生物制品檢定所，純度96.0%)；胎牛血清(HyClone公司)；DMEM培養液(Gibco公司)；LipofectamineTM 2000轉染試劑(北京索萊寶生物科技有限公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)粉末(Sigma公司)；二甲基亞砜(Sigma公司)；TRIzol試劑(北京天根生化科技有限公司)；SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒(Roche公司)；RIPA裂解液(北京天根生化科技有限公司)；骨橋蛋白(OPN)、堿性磷酸酶(ALP)、成骨特異性轉錄因子(Runx2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體及二抗(北京奧維亞生物技術有限公司)；miR-196a-3p模擬物(mimics)和抑制物(inhibitor)、Runx2過表達和抑制表達載體均由廣州銳博生物科技有限公司設計合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養、轉染 CP-R091細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養液中培養，培養箱溫度37℃，CO2質量分數5%，培養至細胞達80%～90%融合時，用胰酶消化細胞進行傳代培養。

取對數生長期的CP-R091細胞，以2×105個/孔接種于6孔板中培養，當細胞達50%～70%融合時，使用LipofectamineTM2000轉染試劑分別將miRNA-inhibitor陰性對照、miR-196a-3p-inhibitor、miRNA-mimics陰性對照、miR-196a-3p-mimics、pcDNA3.1空載體、pcDNA3.1-Runx2、小干擾RNA(siRNA)陰性對照、siRNA-Runx2轉染至細胞，并分別記為anti-miR-NC組、anti-miR-196a-3p組、miR-NC組、miR-196a-3p組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-Runx2組、si-NC組和si-Runx2組，每組設置6個重復孔，轉染24 h后檢測轉染效率。

1.2.2MTT實驗檢測細胞增殖活性 取未轉染的CP-R091細胞以5×103個/孔接種于96孔板，培養箱中培養24 h后，分為葛根素組和對照組。葛根素組分別加入葛根素終濃度0.01 μmol/L、0.10 μmol/L、1.00 μmol/L，對照組加入等體積DMEM完全培養液，繼續培養，分別于加藥后第0、1、3、5天，每孔加入新鮮配制的5 mg/ml的MTT溶液20 μl培養4 h，倒掉孔內液體，每孔加入二甲基亞砜150 μl反應10～15 min。酶標儀檢測每孔490 nm波長處吸光度(A)值。轉染組細胞增殖活性檢測同上。

1.2.3RT-qPCR檢測miR-196a-3p表達 收集生長狀態良好的各組細胞，加入TRIzol試劑抽提總RNA，分光光度計測定RNA樣品濃度和純度，使用Takara逆轉錄酶將RNA逆轉錄合成cDNA，以U6為內參基因使用SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒進行qPCR。miR-196a-3p上游引物序列：5′-GGAACGGCAACAAGAAACTG-3′，下游引物序列：5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′，于上海生工生物工程有限公司合成。qPCR反應程序：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火60 s，共35個循環。結果采用2-△△Ct法計算miR-196a-3p相對表達量。

1.2.4Western印跡檢測細胞分化相關蛋白及Runx2蛋白表達 使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白樣品濃度，將蛋白樣品放入100℃水浴中變性3 min，取50 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，電泳結束后將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，并用封閉液封膜1 h。加入稀釋的OPN、ALP、Runx2、GAPDH抗體4℃孵育過夜，洗膜，加入辣根過氧化酶標記二抗室溫孵育2 h。洗膜，加入電化學發光(ECL)溶液顯色，紫外凝膠成像系統中曝光，應用Image Pro Plus軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為對照計算目的蛋白相對表達量。

1.2.5雙熒光素酶報告基因實驗 為驗證miR-196a-3p是否靶向Runx2，將Runx2的3′UTR和突變的3′UTR構建熒光素酶報告基因載體，分別與miRNA-mimics陰性對照和miR-196a-3p-mimics共轉染大鼠成骨細胞，轉染36 h后收獲細胞并檢測細胞中熒光素酶活性。

1.3統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1葛根素對大鼠成骨細胞CP-R091增殖、分化及細胞中miR-196a-3p表達的影響 與對照組比較，培養第3天，葛根素1.00 μmol/L組細胞增殖活性明顯升高(P<0.05)，培養第5天，葛根素0.10 μmol/L和1.00 μmol/L組細胞增殖活性均明顯升高(P<0.05)；與對照組比較，葛根素0.10 μmol/L和1.00 μmol/L組miR-196a-3p相對表達量明顯降低(P<0.05)，OPN、ALP相對表達量明顯升高(P<0.05)。見圖1、表1。

1～4：對照組、葛根素0.01 μmol/L組、葛根素0.10 μmol/L組、葛根素1.00 μmol/L組圖1 葛根素對CP-R091細胞中OPN、ALP表達的影響

2.2抑制miR-196a-3p對大鼠成骨細胞增殖和分化的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-196a-3p組CP-R091細胞中miR-196a-3p相對表達量明顯降低(P<0.05)，培養第3天和第5天時細胞增殖活性明顯升高(P<0.05)，細胞中OPN、ALP蛋白相對表達水平明顯升高(P<0.05)。見表2、圖2。

1：anti-miR-NC組；2：anti-miR-196a-3p組圖2 抑制miR-196a-3p對大鼠成骨細胞中OPN、ALP表達的影響

2.3過表達miR-196a-3p能夠逆轉葛根素對大鼠成骨細胞增殖和分化的作用 選用對大鼠成骨細胞增殖促進作用較強的葛根素(1.00 μmol/L)做后續實驗。與葛根素+miR-NC組比較，葛根素+miR-196a-3p組CP-R091細胞中miR-196a-3p相對表達量明顯升高(P<0.05)，培養第3天和第5天時細胞增殖活性明顯降低(P<0.05)，細胞中OPN、ALP蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05)。見圖3、表3。

1：葛根素+miR-NC組；2：葛根素+miR-196a-3p組圖3 葛根素對過表達miR-196a-3p的大鼠成骨細胞中OPN、ALP表達的影響

2.4miR-196a-3p靶向Runx2 生物信息學軟件mirtarbase(http：//mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)分析結果顯示(圖4)，miR-196a-3p能夠與Runx2的3′UTR區互補結合。雙熒光素酶報告基因實驗結果，過表達miR-196a-3p明顯抑制大鼠成骨細胞中Runx2的活性，而將Runx2的3′UTR區突變后抑制作用消失。見表4。Western印跡結果表明，過表達miR-196a-3p的大鼠成骨細胞中Runx2表達明顯降低〔miR-NC組(1.02±0.06) vs miR-196a-3p組(0.36±0.03),P<0.05〕，抑制表達miR-196a-3p的大鼠成骨細胞中Runx2表達明顯升高〔anti-miR-NC組(1.01±0.06) vs anti-miR-196a-3p組(1.58±0.08)，P<0.05〕。見圖5。

圖4 miR-196a-3p能夠與Runx2的3′UTR區互補結合

表4 雙熒光素酶報告實驗

1～4:miR-NC組、miR-196a-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-196a-3p組圖5 miR-196a-3p靶向調控Runx2

2.5過表達Runx2對大鼠成骨細胞增殖和分化的影響 與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-Runx2組CP-R091細胞在培養第3天和第5天時細胞增殖活性明顯增強(P<0.05)，細胞中OPN、ALP蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見圖6、表5。

圖6 過表達Runx2對大鼠成骨細胞中OPN、ALP表達的影響

2.6抑制Runx2表達能夠逆轉葛根素對大鼠成骨細胞增殖和分化的作用 與葛根素+si-NC組比較，葛根素+si-Runx2組CP-R091細胞在培養第3天和第5天時細胞增殖活性明顯降低(P<0.05)，細胞中OPN、ALP蛋白表達明顯降低(P<0.05)。見表6、圖7。

1：葛根素+si-NC組；2：葛根素+si-Runx2組圖7 葛根素對抑制Runx2表達的大鼠成骨細胞中OPN、ALP表達的影響

3 討 論

雌激素替代療法是目前治療絕經后骨質疏松的常用方法，可有效降低骨質疏松的發病率，但資料顯示，該方法增加了卵巢癌、子宮內膜癌和乳腺癌的發生風險〔8，9〕。因此植物雌激素的使用受到了高度關注。葛根素是中藥葛根的有效提取成分，其化學結構與雌激素相似，是一種植物雌激素，多項研究表明，葛根素具有增加骨量、促進成骨細胞生長和功能、改善骨代謝的作用，對防治骨質疏松具有良好療效〔10～12〕。本研究使用不同濃度葛根素處理大鼠成骨細胞，MTT實驗檢測細胞增殖活性，并測定成骨細胞分化相關蛋白ALP和OPN的水平，觀察葛根素對大鼠成骨細胞增殖和分化的影響，結果表明葛根素能夠促進大鼠成骨細胞增殖和分化，其中1.00 μmol/L的葛根素效果最好。

近年來，miRNA在成骨分化中的作用越來越受到重視〔13〕。高杰等〔14〕利用基因芯片技術檢測骨髓間充質干細胞成骨誘導分化過程中miRNA差異表達情況，結果表明miR-363等7個miRNAs表達上調，miR-192等6個miRNAs表達下調，證實miRNAs參與調控骨髓間充質干細胞向成骨分化。梁興倫等〔15〕報道，補腎方能通過干預成骨細胞中差異表達的miRNA調控其靶基因進而改善骨質疏松。提示干預骨形成相關miRNA對改善骨質疏松具有重要意義。本研究發現，葛根素處理大鼠成骨細胞后，細胞中miR-196a-3p表達下調，并證實抑制miR-196a-3p表達后成骨細胞增殖和分化能力明顯增強。本研究進一步用葛根素處理過表達miR-196a-3p的成骨細胞，結果發現過表達miR-196a-3p后葛根素對大鼠成骨細胞增殖和分化的促進作用受到抑制。提示葛根素促進大鼠成骨細胞增殖和分化的作用與下調miR-196a-3p有關。

Runx2是成骨分化特異性轉錄因子，能夠促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，并調控多種成骨標志基因的轉錄、參與調控骨形態發生蛋白通路、轉化生長因子β通路及Wnt通路從而促進骨形成〔16～18〕。張瑩瑩等〔19〕報道，葛根素能夠上調成骨細胞中Runx2的表達，其作用可能與干涉靶向Runx2的miRNA有關。本研究利用生物信息學軟件分析發現，miR-196a-3p能與Runx2的3′UTR區特異性結合從而抑制其轉錄活性，并證實抑制表達miR-196a-3p的大鼠成骨細胞中Runx2表達升高，而過表達Runx2明顯促進成骨細胞增殖和分化。為證實Runx2對葛根素促進成骨細胞增殖和分化的影響，本研究用葛根素處理抑制表達Runx2的成骨細胞，結果葛根素對大鼠成骨細胞增殖和分化的促進作用受到抑制，說明抑制Runx2逆轉了葛根素對大鼠成骨細胞增殖和分化的促進作用。因此推測葛根素下調成骨細胞中miR-196a-3p表達，可能通過靶向負調控Runx2的表達，實現促進大鼠成骨細胞增殖和分化的作用。

綜上所述，葛根素能夠有效促進大鼠成骨細胞體外增殖和分化，并證實葛根素通過下調miR-196a-3p靶向促進Runx2的表達影響成骨細胞增殖和分化。本研究為葛根素在骨質疏松臨床防治中的應用提供了實驗基礎。