miR-214-5p調(diào)控HOXA13抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)及纖維化

彭君 彭家清 秦鵬 羅先榮 張敏 (荊州市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北 荊州 434020)

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，長(zhǎng)期的代謝紊亂及高血糖狀態(tài)易引起心血管、腎、神經(jīng)系統(tǒng)等損害及功能障礙，導(dǎo)致糖尿病腎病(DN)等并發(fā)癥〔1〕。DN是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，其致病機(jī)制涉及活性氧(ROS)的產(chǎn)生、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)的積累及蛋白激酶(PK)C等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的活化等，但其具體機(jī)制仍未詳細(xì)闡明〔2〕。DN是導(dǎo)致終末期腎臟病的主要原因，其主要危險(xiǎn)因素包括高血糖、高血壓和遺傳易感性，根據(jù)其病理特征和演變過程可將其分為5期，早期DN采用阻斷多元醇通路、抑制炎癥遞質(zhì)產(chǎn)生和蛋白激酶C通路及晚期糖基化或非糖基化等治療方法可逆轉(zhuǎn)腎臟損害，延緩病理進(jìn)程；而Ⅳ期或Ⅴ期，腎功能將持續(xù)性減退甚至衰竭〔3,4〕。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長(zhǎng)度為18～22 nt的內(nèi)源性非編碼RNA分子，通過與靶mRNA 3′非編碼區(qū)特異性結(jié)合可調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答等生物過程〔5〕。已有研究〔6〕表明，miR-133b，miR-342和miR-30a在2型DN患者尿液中高表達(dá)，其表達(dá)水平與收縮壓-舒張壓、低密度脂蛋白、腎小球?yàn)V過率等有關(guān)，可作為2型DN的生物標(biāo)志物。而miR-214已被證實(shí)在糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中表達(dá)上調(diào)，抑制miR-214可減弱腎小球肥大及系膜擴(kuò)張〔7〕。本研究就miR-214-5p表達(dá)水平對(duì)高糖誘導(dǎo)的HMC細(xì)胞炎癥反應(yīng)及纖維化的影響進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1材料 HMC細(xì)胞(批號(hào)：4200)購自美國(guó)Science Cell公司；胎牛血清(批號(hào)：SH41288)、RPMI1640培養(yǎng)液(批號(hào)：SH30807)購自美國(guó)Gibco-BRL公司；D-葡萄糖(批號(hào)：MB2510)購自大連美侖生物科技公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(批號(hào)：11668027)購自美國(guó)Invitrogen公司；Trizol試劑(批號(hào)：15596)、RIPA裂解液(批號(hào)：R0020)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(批號(hào)：BSP0161)、電化學(xué)發(fā)光(ECL)液(批號(hào)：PE0030)、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：D0010)購自北京Solarbio公司；對(duì)照(control)小干擾RNA(siRNA)、同源盒蛋白(HOXA)13 siRNA由山東維真生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成；HOXA13過表達(dá)載體(pcDNA-HOXA13)由金瑞斯生物科技公司構(gòu)建；TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：RR047A)、TaKaRa實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(批號(hào)：RR820A)購自寶生物工程(大連)有限公司；miR-214-5p熒光定量引物購自TaqMan公司；control抑制劑(inhibitors)、miR-214-5p inhibitors、control模擬物(mimics)、miR-214-5p mimics由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成；兔抗HOXA13(批號(hào)：ab106503)、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1(批號(hào)：ab53013)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)7(批號(hào)：ab27569)、纖維連接蛋白(FN)(批號(hào)：ab2413)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)(批號(hào)：ab8227)抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(批號(hào)：ab6721)購自英國(guó)Abcam公司；Forma TM Steri-cycle TM i160 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國(guó)Thermo公司；Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀購自上海創(chuàng)萌生物科技有限公司；CFX96 Touch TM熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)、ChemiDoc TM MP凝膠成像系統(tǒng)購自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組 使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)HMC細(xì)胞，每天更換新鮮培養(yǎng)液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化后重懸，以6×103個(gè)/孔接種于96孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度約45%，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將control inhibitors、miR-214-5p inhibitors、control mimics、miR-214-5p mimics、pcDNA空載體、pcDNA-HOXA13、miR-214-5p inhibitors和control siRNA、miR-214-5p inhibitors和HOXA13 siRNA轉(zhuǎn)染至HMC細(xì)胞；將細(xì)胞分為NG組、HG組、Control組、anti-miR-con組、anti-miR-214-5p組、HG+anti-miR-con組、HG+anti-miR-214-5p組、HG+pcDNA組、HG+pcDNA-HOXA13組、HG干預(yù)(anti-miR-con、anti-miR-214-5p、anti-miR-214-5p+pcDNA、anti-miR-214-5p+pcDNA-HOXA13)組。

處理方法：NG組(含5 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h)；HG組(含30 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h)；Control組(常規(guī)培養(yǎng))；anti-miR-con組(轉(zhuǎn)染control inhibitors)；anti-miR-214-5p組(轉(zhuǎn)染miR-214-5p inhibitors)；HG+anti-miR-con組(轉(zhuǎn)染control inhibitors后以30 mmol/L D-葡萄糖處理48 h)；HG+anti-miR-214-5p組(轉(zhuǎn)染miR-214-5p inhibitors后30 mmol/L D-葡萄糖處理48 h)、HG+pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA后30 mmol/L D-葡萄糖處理48 h)；HG+pcDNA-HOXA13組(轉(zhuǎn)染pcDNA-HOXA13后30 mmol/L D-葡萄糖處理48 h)；HG干預(yù)(anti-miR-con、anti-miR-214-5p、anti-miR-214-5p+pcDNA、anti-miR-214-5p+pcDNA-HOXA13)組(分別轉(zhuǎn)染control inhibitors、miR-214-5p inhibitors、miR-214-5p inhibitors+pcDNA、miR-214-5p inhibitors+pcDNA-HOXA13后30 mmol/L D-葡萄糖48 h)。

1.3RT-qPCR 收集NG組、HG組、Control組、anti-miR-con組和anti-miR-214-5p組細(xì)胞，充分研磨，Trizol法提取總RNA，微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次。采用F=2-△△Ct法分析miR-214-5p相對(duì)表達(dá)量。β-actin引物：上游：5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游：5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′。

1.4Western印跡 各組細(xì)胞中加入RIPA裂解液，置于冰上裂解細(xì)胞，4℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清。將蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入兔抗HOXA13(1∶500)、ICAM-1(1∶2 000)、BMP7(1∶500)、FN(1∶500)和β-actin(1∶1 000)抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌；ECL發(fā)光顯影，每個(gè)蛋白樣品重復(fù)3次。

1.5雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 取HMC細(xì)胞，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將HOXA13 3′UTR野生型質(zhì)粒或突變型質(zhì)粒分別與control mimics、miR-214-5p mimics、control inhibitors和miR-214-5p inhibitors共轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h后加入裂解液裂解。4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1高糖誘導(dǎo)HMC細(xì)胞中miR-214-5p表達(dá)上調(diào) HG組細(xì)胞中miR-214-5p表達(dá)水平顯著高于NG組(4.67±0.35 vs 1.01±0.10;t=30.164,P<0.001)。

2.2HMC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-214-5p inhibitors的效率檢驗(yàn) Control組miR-214-5p相對(duì)表達(dá)水平為1.00±0.14；anti-miR-214-5p組細(xì)胞中miR-214-5p相對(duì)表達(dá)水平顯著低于anti-miR-con組(0.33±0.08 vs 0.96±0.13;P<0.001)。

2.3下調(diào)miR-214-5p表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的HMC細(xì)胞炎癥反應(yīng)及纖維化 對(duì)比NG組，高糖刺激的HMC細(xì)胞中ICAM-1和FN蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，BMP7蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；而將miR-214-5p inhibitors轉(zhuǎn)染至HMC細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后，高糖刺激的細(xì)胞中ICAM-1和FN蛋白表達(dá)水平較HG+anti-miR-con組顯著降低(P<0.05)，而BMP7蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖1、表1。

1～4：NG組、HG組、HG+anti-miR-con組、HG+anti-miR-214組圖1 Western印跡檢測(cè)ICAM-1、BMP7、FN蛋白表達(dá)

表1 下調(diào)miR-214-5p表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的HMC細(xì)胞炎癥反應(yīng)及纖維化

2.4miR-214-5p靶向調(diào)控HOXA13表達(dá) 通過Targetscan在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，HOXA13 3′UTR上存在miR-214-5p的結(jié)合位點(diǎn)(圖2)；miR-214-5p mimics與HOXA13 3′UTR-WT共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性下降(0.35±0.06 vs 1.00±0.11;t=15.563,P<0.001)，而與HOXA13 3′UTR-MUT共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性無明顯變化(0.99±0.11、0.98±0.07；t=0.230,P=0.821)；并且過表達(dá)miR-214-5p，HOXA13蛋白表達(dá)水平顯著降低(0.30±0.06 vs 1.00±0.10，P<0.05)，抑制miR-214-5p表達(dá)則HOXA13蛋白表達(dá)水平顯著升高(1.86±0.14 vs 0.98±0.08,P<0.05)。見圖3。

圖2 miR-214-5p靶向調(diào)控HOXA13的表達(dá)

1～4：miR-con組、miR-214組、anti-miR-con組、anti-miR-214組圖3 Western印跡檢測(cè)HOXA13蛋白表達(dá)

2.5過表達(dá)HOXA13抑制高糖誘導(dǎo)的HMC細(xì)胞炎癥反應(yīng)及纖維化 與NG組比較，高糖刺激的HMC細(xì)胞中ICAM-1和FN蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，BMP7蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；而將pcDNA-HOXA13轉(zhuǎn)染至HMC細(xì)胞后，高糖刺激的細(xì)胞中ICAM-1和FN蛋白表達(dá)水平較HG+pcDNA組顯著降低(P<0.05)，而BMP7蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖4和表2。

1～4:NG組、HG組、HG+pcDNA組、HG+pcDNA+HOXA13組圖4 Western印跡檢測(cè)HOXA13、ICAM-1、BMP-7、FN蛋白表達(dá)比較

2.6miR-214-5p和HOXA13對(duì)高糖干預(yù)的HMC細(xì)胞TGF-β1信號(hào)通路的影響 HG組TGF-β1蛋白表達(dá)水平顯著高于NG組(3.10±0.30 vs 1.00±0.11,P<0.05)；HG+anti-miR-214組TGF-β1蛋白表達(dá)水平較HG+anti-miR-con組顯著降低(1.30±0.10 vs 3.17±0.28,P<0.05)；HG+anti-miR-214+si-HOXA13組TGF-β1蛋白表達(dá)水平較HG+anti-miR-214+si-con組顯著升高(2.70±0.12 vs 1.40±0.13,P<0.05)。見圖5。

1～6:NG組、HG組、anti-miR-con組、anti-miR-214組、anti-miR-214+si-con組、anti-miR-214+si-HOXA13組圖5 Western印跡檢測(cè)TGF-β1蛋白表達(dá)

3 討 論

TGF-β1在DN發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，可與跨膜受體結(jié)合而激活Ⅰ型受體，活化的Ⅰ型受體進(jìn)一步催化下游信號(hào)分子Smads磷酸化，從而誘導(dǎo)下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)〔8〕。TGF-β1可刺激成纖維細(xì)胞分泌FN、層黏蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，同時(shí)促進(jìn)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)〔9〕。BMP-7屬于TGF-β超家族，是一種分泌型多功能蛋白，可上調(diào)鈣黏附蛋白E表達(dá)，逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞分化，同時(shí)抑制上皮細(xì)胞凋亡并減少炎性細(xì)胞因子釋放，從而拮抗TGF-β1的促纖維化作用〔10〕。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族，能夠通過與其受體特異性結(jié)合增強(qiáng)炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附作用，可促進(jìn)炎癥反應(yīng)；抑制FN、TGF-β1和ICAM-1蛋白表達(dá)可減緩腎纖維化〔11〕。

miRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)代謝過程中起重要作用，其異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道〔12,13〕，miRNA能夠調(diào)控胰島素分泌，通過調(diào)控血管緊張素(Ang)Ⅱ、TGF等抑制腎間質(zhì)纖維化，緩解腎小球損傷，并抑制炎癥反應(yīng)和足細(xì)胞凋亡。研究〔14〕表明，miR-214可通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、Ⅰ型膠原表達(dá)，抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞纖維化；過表達(dá)miR-214能夠增強(qiáng)肝細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)肝纖維化形成〔15〕。此外，已有相關(guān)研究〔16〕證實(shí)，miR-214-5p在肝細(xì)胞中異常表達(dá)，過表達(dá)miR-214-5p可上調(diào)MMP-2、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和TGF-β1等纖維化相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)肝纖維化。本研究以30 mmol/L D-葡萄糖刺激HMC細(xì)胞，細(xì)胞中miR-214-5p表達(dá)上調(diào)，ICAM-1和FN蛋白表達(dá)水平升高而SMP-7蛋白表達(dá)水平降低；抑制miR-214-5p表達(dá)則細(xì)胞中ICAM-1、FN和SMP-7蛋白表達(dá)水平的升高或降低均有所恢復(fù)。提示，miR-214-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)的HMC細(xì)胞纖維化具有抑制作用。通過Targetscan在線預(yù)測(cè)、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及Western印跡驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，miR-214-5p可靶向調(diào)節(jié)HOXA13蛋白表達(dá)。

同源盒基因(HOX)基因最早在果蠅被中發(fā)現(xiàn)，能夠調(diào)控組織器官發(fā)育并維持其正常生物學(xué)功能，在胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等組織器官發(fā)育中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用〔17〕。HOXA13在胃癌、膠質(zhì)瘤等病灶組織中異常表達(dá)，其表達(dá)水平與病情分級(jí)和預(yù)后密切相關(guān)，能夠通過調(diào)節(jié)磷酸化Smad蛋白表達(dá)及TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)細(xì)胞侵襲及EMT〔18,19〕。而在高糖誘導(dǎo)的HK-2人腎小管上皮細(xì)胞中，HOXA13和BMP-7蛋白表達(dá)水平顯著降低，通過上調(diào)HOXA13表達(dá)可抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT的發(fā)生〔20〕。此外，彭力等〔21〕采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)在人腎小管上皮細(xì)胞中上調(diào)HOXA13表達(dá)發(fā)現(xiàn)，BMP-7表達(dá)上調(diào)，高糖誘導(dǎo)的EMT受到抑制。本文將pcDNA-HOXA13轉(zhuǎn)染至HMC細(xì)胞后，ICAM-1和FN蛋白表達(dá)顯著受到抑制；SMP-7蛋白表達(dá)水平升高，這一結(jié)果與文獻(xiàn)〔21〕一致。而采用RNAi技術(shù)沉默HOXA13表達(dá)可逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-214-5p對(duì)TGF-β1蛋白表達(dá)的抑制作用。

綜上所述，高糖可刺激HMC細(xì)胞中miR-214-5p高表達(dá)，通過抑制miR-214-5p可靶向負(fù)調(diào)控HOXA13表達(dá)，從而激活TGF-β1通路，發(fā)揮抗炎和抗纖維化作用；提示，miR-214-5p可能成為糖尿病腎病的生物標(biāo)志物，并且miR-214-5p和HOXA13有望成為DN治療的新靶點(diǎn)。