超聲波輔助提取長(zhǎng)裙竹蓀抑菌物質(zhì)工藝優(yōu)化及其抑菌活性研究

張永杰，江麗慧，潘明，唐甜甜，陳存，張薇*

(1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.成都師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，成都 611130)

竹蓀為鬼筆目、鬼筆科、竹蓀屬的大型食用菌[1]。竹蓀具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其子實(shí)體中含有21種氨基酸以及多種維生素[2]。竹蓀子實(shí)體提煉出的竹蓀精是一種味道極其鮮美的純菌類調(diào)味品，因富含氨基酸，放入食材中非常美味。竹蓀除可提取調(diào)味品外，對(duì)食品防腐也具有奇效，“與肉共食，味鮮防腐”，在夏季，加入竹蓀的煮熟菜肴可以較長(zhǎng)時(shí)間不腐敗變質(zhì)[3]，這說(shuō)明竹蓀加工的調(diào)味品可能具有防腐功效，這是其他調(diào)味品所不具備的優(yōu)勢(shì)。藍(lán)蔚青等[4]和郝景雯等[5]的研究表明，竹蓀提取液對(duì)食源性病原菌，如大腸桿菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌與單增李斯特菌均有抑菌作用。然而，竹蓀作為天然抑菌劑，目前對(duì)其抑菌效果的研究主要集中于食源性病原菌，對(duì)果蔬致腐菌抑菌效果的研究尚少。胡蘿卜軟腐歐文氏菌和層出鐮刀霉是兩種常見(jiàn)的果蔬致腐菌，能夠造成芥菜軟腐病和枸杞鮮果病害[6-7]。因此，本研究以這兩種果蔬致腐菌為供試菌，為進(jìn)一步研究竹蓀提取液對(duì)果蔬致腐菌的抑菌作用提供了參考。

抑菌物質(zhì)的提取方法有許多，其中，超聲波提取法因效率高、穿透能力強(qiáng)，能使細(xì)胞發(fā)生物理性破裂而受到重視。關(guān)于超聲波提取竹蓀抑菌物質(zhì)的研究雖然已出現(xiàn)，然而尚未優(yōu)化提取試劑和超聲波提取參數(shù)，如料液比、功率和時(shí)間等?；诖?，本研究以長(zhǎng)裙竹蓀為研究對(duì)象，針對(duì)兩種常見(jiàn)果蔬致腐菌(層出鐮刀霉、胡蘿卜軟腐歐文氏菌)，采用3種常用提取劑(水、90%乙醇、乙酸乙酯)進(jìn)行提取，篩選出最佳提取劑和敏感性更高的果蔬致腐菌，并采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)超聲波輔助提取法參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝，以期為竹蓀用于開(kāi)發(fā)天然綠色抑菌劑提供參考，并推廣其在果蔬防腐領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)原材料

長(zhǎng)裙竹蓀：2019年7月購(gòu)于宜賓市長(zhǎng)寧縣；馬鈴薯：2019年7月購(gòu)于自貢市匯東農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.1.2 供試菌株

大腸桿菌(Escherichiacoli)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovora)、層出鐮刀霉(Fusariumproliferatum)：均由四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理

將長(zhǎng)裙竹蓀置于60～70 ℃的烘箱中，烘干至恒重。采用植物粉碎機(jī)粉碎，粉末過(guò)80目篩后得到長(zhǎng)裙竹蓀干粉，備用。

1.2.2 最佳提取劑的篩選

分別以水、90%乙醇、乙酸乙酯為提取劑，采用超聲波輔助提取法得到長(zhǎng)裙竹蓀提取液。采用抑菌圈法分別測(cè)定3種提取劑下得到的提取液對(duì)3種供試菌種(大腸桿菌、胡蘿卜軟腐歐文氏菌、層出鐮刀霉)的抑菌效果，其中大腸桿菌為對(duì)照菌種。前人的研究表明，長(zhǎng)裙竹蓀提取液對(duì)大腸桿菌具有很好的抑菌效果，因此選擇大腸桿菌作為對(duì)照菌種。以抑菌圈直徑為指標(biāo)，研究3種提取劑對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀提取液抑菌效果的影響，得到最佳提取劑，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀提取液最敏感果蔬致腐菌的篩選

以乙酸乙酯為提取劑，采用超聲波輔助提取法得到長(zhǎng)裙竹蓀提取液。采用抑菌圈法測(cè)定乙酸乙酯作為提取劑時(shí)，長(zhǎng)裙竹蓀提取液對(duì)3種供試菌種(大腸桿菌、胡蘿卜軟腐歐文氏菌、層出鐮刀霉)的抑菌效果，其中大腸桿菌為對(duì)照菌種。以抑菌圈直徑為指標(biāo)，研究3種菌對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀提取液敏感性的高低，并得到敏感性最高的菌種。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

表1 菌種抑菌敏感性的判定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The criteria for determining antibacterial sensitivity of strains

1.2.4 超聲波輔助提取試驗(yàn)優(yōu)化

通過(guò)前期預(yù)試驗(yàn)及考慮原材料成本，確定菌液的濃度為10 μL，抑菌物質(zhì)添加量為5 μL，培養(yǎng)時(shí)間為15.5 h時(shí)，菌液濃度變化最明顯。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，采用吸光度法得出的結(jié)果更加準(zhǔn)確直觀。

1.2.4.1 單因素選擇

在菌液添加量為10 μL，抑菌物質(zhì)添加量為5 μL的條件下，設(shè)置20，30，40，50，60 min 5個(gè)不同的超聲時(shí)間，350，420，490，560，630 W 5個(gè)不同的超聲功率，1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL)5個(gè)不同的料液比進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究 3個(gè)主要影響因素：超聲時(shí)間、超聲功率、料液比對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀提取液抑菌效果的影響[8-10]。

1.2.4.2 正交優(yōu)化超聲波輔助提取試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)正交優(yōu)化試驗(yàn)來(lái)確定超聲波提取的最佳工藝。以15.5 h時(shí)間段的吸光度為指標(biāo)，反映出菌懸液濃度，進(jìn)而比較長(zhǎng)裙竹蓀提取液的抑菌效果，得到最佳提取條件。選取影響顯著的3個(gè)因素：超聲時(shí)間(A)、超聲功率(B)、料液比(C)進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)Table 2 The factors and levels design of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳提取劑的篩選

不同試劑對(duì)提取物成分及濃度有重要影響。對(duì)于不同的提取對(duì)象，最佳提取劑也不一定相同。已有研究表明，水、90%乙醇和乙酸乙酯被用于提取長(zhǎng)裙竹蓀抑菌物質(zhì)[11-12]。因此，本試驗(yàn)選擇這3種試劑來(lái)提取長(zhǎng)裙竹蓀抑菌物質(zhì)，篩選出最佳提取劑。根據(jù)前人文獻(xiàn)可知，本試驗(yàn)水提采取的料液比是1∶20 (g/mL)，90%乙醇采用的料液比為1∶10 (g/mL)，乙酸乙酯采用的料液比為1∶20 (g/mL)。

表3 3種提取劑提取的長(zhǎng)裙竹蓀提取液對(duì)3種菌抑菌圈直徑的影響Table 3 The effects of Dictyophora indusiata extraction solution extracted by three extractants on the inhibition zone diameters of three bacteria

圖1 3種提取劑提取的長(zhǎng)裙竹蓀提取液對(duì)3種菌的抑菌效果Fig.1 The antibacterial effects of Dictyophora indusiata extraction solution extracted by three extractants on three bacteria

由表3和圖1可知，乙酸乙酯提取的長(zhǎng)裙竹蓀液對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌、層出鐮刀霉兩種抑菌抑菌圈直徑均最大，分別為11.5 mm和16.6 mm，而對(duì)照組大腸桿菌的抑菌直徑為11.2 mm。水作為提取劑獲得的粗提物抑菌效果均最弱，胡蘿卜軟腐歐文氏菌、層出鐮刀霉兩種菌的抑菌圈直徑分別為6.0 mm和9.5 mm，而對(duì)照組大腸桿菌的抑菌圈直徑僅為6.1 mm。長(zhǎng)裙竹蓀的90%乙醇提取物抑菌效果介于乙酸乙酯和水之間，對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌、層出鐮刀霉的抑菌圈直徑分別為9.9 mm和14.7 mm，大腸桿菌的抑菌圈直徑為9.5 mm。因此表明，長(zhǎng)裙竹蓀乙酸乙酯提取物對(duì)3種供試菌的抑菌效果最好。由此得出，當(dāng)乙酸乙酯作為提取劑時(shí)，能更好地破壞長(zhǎng)裙竹蓀的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)長(zhǎng)裙竹蓀中抑菌物質(zhì)的提出，故選擇乙酸乙酯作為長(zhǎng)裙竹蓀的提取劑進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.2 對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀提取液最敏感果蔬致腐菌的篩選

不同果蔬致腐菌對(duì)同一種抑菌物質(zhì)表現(xiàn)出的敏感性具有差異性。李雯霞等[13]發(fā)現(xiàn)野油菜黃單胞菌、產(chǎn)黃青霉、灰色葡萄孢霉等果蔬致腐菌對(duì)芍藥花提取物表現(xiàn)出的敏感性具有很大差異性。因此，本試驗(yàn)選擇胡蘿卜軟腐歐文氏菌、層出鐮刀霉兩種果蔬致腐菌，研究其對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀提取液的敏感性大小，篩選出最敏感的致腐菌。2.1中用乙酸乙酯提取時(shí)，采用的料液比為1∶20 (g/mL)，得到的抑菌圈直徑均屬于低度敏感菌范圍，因此將料液比1∶20 (g/mL)擴(kuò)大1倍為1∶10 (g/mL)。

表4 3種菌對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀提取液的敏感性大小 Table 4 The sensitivity of three bacteria to Dictyophora indusiata extraction solution

圖2 3種菌的抑菌圈直徑大小Fig.2 The inhibition zone diameters of three bacteria

由表4和圖2可知，以乙酸乙酯為提取劑時(shí)，層出鐮刀霉培養(yǎng)基中的抑菌圈直徑最大，其平均抑菌圈直徑菌大于18 mm，為19.1 mm。對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀提取液表現(xiàn)為高度敏感。胡蘿卜軟腐歐文氏菌培養(yǎng)基中的平均抑菌圈直徑與層出鐮刀霉的相差不大，為18.2 mm，對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀提取液表現(xiàn)為高度敏感，其中大腸桿菌作為對(duì)照，敏感性最低，抑菌直徑為9.4 mm。結(jié)果表明，長(zhǎng)裙竹蓀中提取出的抑菌物質(zhì)對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌和層出鐮刀霉的生長(zhǎng)代謝抑制效果都非常好。然而，層出鐮刀霉是真菌，不太適合用于液體培養(yǎng)，故本項(xiàng)目選擇更適合用于液體培養(yǎng)的細(xì)菌，以胡蘿卜軟腐歐文氏菌作為目的菌進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.3 超聲波提取試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 單因素試驗(yàn)及其分析

2.3.1.1 超聲時(shí)間對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀提取液抑菌效果的影響

不同超聲時(shí)間對(duì)抑菌物質(zhì)的提取有重要影響，每種天然提取物都有其最適的超聲提取時(shí)間。本試驗(yàn)以乙酸乙酯為提取劑，胡蘿卜軟腐歐文氏菌為目的菌，測(cè)定了不同超聲時(shí)間對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀抑菌物質(zhì)的提取和抑菌效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)菌懸液吸光度的影響 Fig.3 The effect of ultrasonic time on the absorbance of bacterial suspension

由圖3可知，菌懸液的濃度隨時(shí)間的延長(zhǎng)不斷變化，總體呈先降低后升高的趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，菌懸液的濃度最低，對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抑制效果最好。張子龍等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，茉莉花茶中抑菌物質(zhì)的提取濃度隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后降低的趨勢(shì)，在20 min時(shí)，抑菌物質(zhì)的提取濃度最大，說(shuō)明超聲時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)均不利于抑菌物質(zhì)的提取。超聲時(shí)間過(guò)短，導(dǎo)致提取不充分；超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致抑菌成分被破壞，因此，當(dāng)菌懸液濃度在超聲時(shí)間30 min達(dá)到最低后再延長(zhǎng)超聲時(shí)間毫無(wú)意義。

2.3.1.2 超聲功率對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀提取液抑菌效果的影響

超聲波壓強(qiáng)會(huì)對(duì)原料產(chǎn)生空化作用，采用超聲波提取天然抑菌物質(zhì)時(shí)，抑菌物質(zhì)濃度往往會(huì)隨著超聲功率的提高呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)。曹小燕等[15]的研究表明，油菜籽粕中提取的抑菌物質(zhì)濃度隨著超聲功率的提高呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。

圖4 超聲功率對(duì)菌懸液吸光度的影響Fig.4 The effect of ultrasonic power on the absorbance of bacterial suspension

由圖4可知，隨著超聲功率的升高，菌懸液的濃度先降低后升高，當(dāng)超聲功率達(dá)到490 W時(shí)，菌懸液的濃度最低，長(zhǎng)裙竹蓀提取液中抑菌物質(zhì)的濃度最高，對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抑制效果最好，之后菌懸液的濃度逐漸升高。出現(xiàn)此情況的原因可能是超聲波具有較強(qiáng)的機(jī)械剪切作用，當(dāng)超聲功率過(guò)高時(shí)，抑菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致抑菌物質(zhì)的提取量下降。因此，超聲功率選擇490 W為宜。

2.3.1.3 料液比對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀提取液抑菌效果的影響

料液比會(huì)對(duì)抑菌物質(zhì)的提取產(chǎn)生直接影響，從而間接影響菌懸液的濃度。由表5可知，在一定范圍內(nèi)菌懸液的濃度隨著料液比的增大而降低，當(dāng)料液比達(dá)到1∶20 (g/mL)后，菌懸液濃度隨著料液比的增大呈緩慢升高的趨勢(shì)。出現(xiàn)此情況的原因可能是：一定量的長(zhǎng)裙竹蓀粉末，在一定范圍內(nèi)，當(dāng)液體增加時(shí)，與液體的接觸面積增加，有利于抑菌物質(zhì)的溶出。當(dāng)液體量過(guò)多時(shí)，液體會(huì)吸收超聲波的輻射，從而使細(xì)胞破壁的作用降低，抑菌物質(zhì)的提取趨于穩(wěn)定。因此，料液比選擇1∶20 (g/mL) 為宜。

表5 料液比對(duì)菌懸液吸光度的影響Table 5 The effect of solid-liquid ratio on the absorbance of bacterial suspension

2.3.2 正交優(yōu)化結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比、功率、時(shí)間進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，以獲得最佳提取條件。正交試驗(yàn)的結(jié)果及分析見(jiàn)表6和表7。

表6 正交組無(wú)粗提物菌液對(duì)照結(jié)果Table 6 The control results of bacterial solution without crude extract in orthogonal group

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 7 The results of orthogonal test

由表6可知，未加入長(zhǎng)裙竹蓀提取液時(shí)，3次測(cè)定菌懸液的吸光度值及其平均吸光度值。由表7中的極差R值可知，R值越大，該因素的水平變動(dòng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響越大，影響長(zhǎng)裙竹蓀抑菌物質(zhì)提取的3個(gè)因素順序?yàn)榱弦罕?C)>超聲時(shí)間(A)>超聲功率(B)。因此，根據(jù)單因素和正交試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮，超聲波輔助提取長(zhǎng)裙竹蓀抑菌物質(zhì)的最優(yōu)方案為A3B3C2，即超聲時(shí)間40 min，超聲功率560 W，料液比1∶20 (g/mL)。

3 結(jié)論

此項(xiàng)目針對(duì)兩種常見(jiàn)的果蔬致腐菌(胡蘿卜軟腐歐文氏菌、層出鐮刀霉)，采用3種提取劑進(jìn)行提取。發(fā)現(xiàn)在應(yīng)用3種提取劑的情況下均能提取出抑菌物質(zhì)，且對(duì)兩種果蔬致腐菌和大腸桿菌均有抑制效果，其中乙酸乙酯為最佳提取劑，同時(shí)，胡蘿卜軟腐歐文氏菌和層出鐮刀霉較大腸桿菌均對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀乙酸乙酯提取液表現(xiàn)更為敏感。長(zhǎng)裙竹蓀提取液對(duì)果蔬致腐菌的抑制機(jī)理尚不明確，后期可從細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)及呼吸代謝幾個(gè)方面探究抑制機(jī)理。

以乙酸乙酯為提取劑，檢測(cè)細(xì)菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌菌懸液渾濁度來(lái)反映抑菌效果，通過(guò)單因素和正交優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀提取條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化提取條件為：超聲時(shí)間40 min，超聲功率560 W，料液比1∶20 (g/mL)，在此條件下長(zhǎng)裙竹蓀提取液的抑菌效果最好，且影響抑菌效果因素的主次關(guān)系依次為料液比(C)>時(shí)間(A)>功率(B)。本研究未考慮到溫度、pH等條件對(duì)該提取方法的影響，后期可進(jìn)一步研究溫度、pH等條件對(duì)該提取方法的影響。再者，對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀其他部位，特別是廢棄部分進(jìn)行更高效的開(kāi)發(fā)利用，以求開(kāi)發(fā)天然防腐劑，并作用于果蔬甚至是肉質(zhì)品等食品領(lǐng)域，既能抑制果蔬和肉制品等食品腐爛，又能作為調(diào)味品應(yīng)用于果汁、果醬、水果沙拉、肉制品等食品中增加鮮味，兼具防腐抑菌和調(diào)味功能。