橄欖花椒油抗氧化、抑菌作用及貯藏特性的研究

肖嵐，熊敏，幸勇，唐英明

(1.四川旅游學院 食品學院，成都 610100；2.四川五豐黎紅食品有限公司，四川 雅安 625300；3.四川旅游學院 烹飪學院，成都 610100)

花椒是蕓香科花椒屬植物，其成熟果皮干燥后，味辛麻、香氣濃郁，是川菜烹飪的傳統香辛料，有“川味花椒之王”的美譽。同時，花椒也是《中國藥典》中記載的常用中藥材，具有降血壓、抗癌、麻醉鎮痛、防蟲抑菌等功能[1]。花椒油是常見的花椒精深加工產品之一，具有花椒特有的香氣和麻味，市售花椒油常采用食用油直接浸泡花椒制成，且常用食用油為純菜籽油，浸泡生產工藝普遍為熱浸提[2]。

橄欖油作為一種用途廣泛的烹飪用油，既可作為各種涼菜的拌料用油，也是煎炸爆炒等的理想烹飪用油，因其在200～220 ℃不易發生氧化且不易滲入食物內部。同時，橄欖油作為一種高檔保健食用油，富含不飽和脂肪酸 (油酸占55%～83%)、多酚類、谷甾醇、角鯊烯和維生素E等營養成分[3]。隨著國內居民收入水平和生活品質的提高，橄欖油已在國內出現“普及”趨勢。然而，初榨橄欖油揮發性物質獨特，具有特殊的青草味[4]，部分國人不太能接受，因此，為方便中國消費者對橄欖油的食用，本團隊已研發出橄欖花椒油并申請了專利[5]，且在試驗的前期研究中采用氣相色譜(gas chromatography， GC)和離子遷移譜(ion mobility spectrometry， IMS)的聯用技術對橄欖調和油(摻入不同比例的菜籽油)制備的花椒油的揮發性風味成分進行了分析，根據指紋圖譜及主成分分析獲得橄欖油與菜籽油的最佳調和比例。與純橄欖花椒油風味最為接近的是摻入90%橄欖油的花椒油；與純菜籽花椒油風味最為接近的是摻入20%橄欖油的花椒油。為進一步獲得橄欖花椒油的抗氧化、抑菌作用以及貯藏特性的基礎數據，本研究以摻入20%橄欖油、90%橄欖油和100%橄欖油的花椒油作為研究對象，純菜籽花椒油作為陽性對照，研究橄欖花椒油的貯藏性質，以及抗氧化、抑菌作用，為橄欖花椒油在市場上的推廣提供了理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干紅花椒：四川漢源貢椒；一級壓榨菜籽油：成都市新興糧油有限公司；冷榨初榨橄欖油：四川省廣元市榮生源食品有限公司；α-生育酚試劑盒：蘇州科銘生物技術有限公司；蘆丁標準品、沒食子酸標準品：美國 Sigma 公司；ABTS [2,2＇-聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽]、DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、二甲基亞砜、異丙醇等：均為化學純；其他化學試劑：均為國產分析純，國藥集團化學試劑有限公司；大腸桿菌 (Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)：四川農業大學食品學院微生物實驗室保藏菌株。

1.2 儀器與設備

Allegra 21R臺式高速冷凍離心機 美國Beckman公司；UV-8000紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；電熱恒溫生化培養箱 上海鴻都電子科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；生物安全柜 上海力申科學儀器有限公司；各規格移液器 德國Eppendorf公司；旋轉蒸發儀 上海那艾儀器有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS) 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花椒油的制備

1.3.1.1 橄欖花椒油的制備

選取花椒并剔除花椒的雜質。初次浸泡：將花椒送入破碎機中鏟破花椒表皮油胞，再加入常溫橄欖油進行浸泡，獲得冷浸橄欖花椒油。第一次分離：將初次浸泡產生的冷浸橄欖花椒油和花椒粒進行分離，將冷浸橄欖花椒油放入第一暫存設備中，將花椒粒分離出。高溫浸泡：將第一次分離出的花椒粒與溫度120～180 ℃的橄欖油進行高溫浸泡，獲得熱浸橄欖花椒油和花椒的混合物。第二次分離：將熱浸橄欖花椒油和花椒進行分離，將熱浸橄欖花椒油放入第二暫存設備中。調配：將第一次分離產生的冷浸橄欖花椒油和第二次分離產生的熱浸橄欖花椒油按一定比例進行混合。

1.3.1.2 純菜籽花椒油的制備

采用四川五豐黎紅食品有限公司的發明專利技術制備純菜籽花椒油。花椒伴隨植物油粉碎→攪拌→浸泡→過濾→分離→過濾→沉淀。生產工藝設備包括粉碎機、螺旋攪拌機、離心機、輸油管、板框過濾機。油溫控制在100～200 ℃，花椒油由花椒在植物油中的浸出物及其混合油液組成。

1.3.2 橄欖花椒油抗氧化作用的研究

1.3.2.1 抗氧化組分的測定

α-生育酚含量的測定采用α-生育酚試劑盒，參考試劑盒說明書進行檢測；谷甾醇含量的測定參考 GB/T 25223-2010《動植物油脂 甾醇組成和甾醇總量的測定 氣相色譜法》；角鯊烯含量的測定參考張東等[6]的方法；花椒油多酚含量的測定參考熊汝琴等[7]的方法；花椒油總黃酮含量的測定參考柴麗琴[8]的方法。

1.3.2.2 抗氧化指標的測定

參考李杰等[9]的方法，測定花椒油對 DPPH·、ABTS+·、·OH 的清除能力。參考 Ozkan G等[10]的方法測定總抗氧化能力，參考高亞妮等[11]的方法測定還原力。半抑制濃度值(IC50)的測定參考李杰等的方法，將花椒油使用二甲亞砜稀釋成不同濃度(實驗點≥5)，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0 mg/mL，分別測定其·OH 清除率、還原力、ABTS+· 清除率、DPPH· 清除率、總抗氧化能力。以樣品濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制成曲線，根據曲線計算IC50值，IC50值越小，抗氧化能力越強。

1.3.3 橄欖花椒油抑菌作用的研究

1.3.3.1 菌懸液的制備

將實驗室4 ℃斜面保存的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌劃線接種于LB固體培養基中，在37 ℃、150 r/min培養24 h 后，用LB 液體培養基稀釋至濃度為 106～107CFU/mL的菌懸液待用。

1.3.3.2 抑菌圈的測定

向LB固體培養基中分別加入0.2 mL 3種供試菌懸液，涂布均勻后貼上用不同質量濃度(0，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/mL)花椒油溶液浸泡過的無菌濾紙片，以二甲亞砜作為對照。將平板于37 ℃培養24 h后用十字交叉法測定抑菌圈直徑[12]。

1.3.3.3 最小抑菌濃度的測定

測定各花椒油對 3 種試驗菌株的最小抑菌濃度(MIC)，取 1 mL各質量濃度(0，0.125，0.250，0.500，1.000 mg/mL)的花椒油溶液，均勻涂布在含3種供試菌的平板上，以二甲亞砜作為對照，在37 ℃、150 r/min條件下培養24 h，觀察細菌的生長情況，無菌生長的最低濃度為 MIC[13]。

1.3.4 橄欖花椒油貯藏特性的研究

采用方正等[14]的烘箱法(60 ℃)進行油脂加速氧化試驗以評價橄欖花椒油的貯藏性能。各花椒油分別取100 mL分裝于多個食品級聚乙烯瓶中，然后放入(60±1) ℃的恒溫烘箱內，分別于第0，6，12，18，24，30 天取出樣品，參照GB 5009.229-2016測定酸價，參照 GB 5009.227-2016測定過氧化值。

1.4 數據處理

試驗數據經3次平行試驗后得到，均以平均數±標準差表示，采用Excel和SPSS 19.0統計軟件對數據進行統計處理和顯著性分析，顯著水平設為 P<0.05。

2 結果和分析

2.1 橄欖花椒油體外抗氧化作用分析

2.1.1 橄欖花椒油中抗氧化組分含量的分析

表1 橄欖花椒油中的抗氧化組分Table 1 The antioxidant components in olive Zanthoxylum oil

初榨橄欖油中含有的 α-生育酚約占所有生育酚的90%～95%左右，且α-生育酚的生物活性最好，是公認的有效抗氧自由基分子，故α-生育酚含量與橄欖油品質有密切關系。由表1可知，YJ花椒油中的 α-生育酚含量最高，為 12.35 mg/100 g，而 GL花椒油中的α-生育酚含量只有9.51 mg/100 g，但無顯著差異(P>0.05)；另外，2-8花椒油中的α-生育酚含量(11.23 mg/100 g)高于GL花椒油。由以上結果可知，GL花椒油中的α-生育酚含量較低，且遠低于四川廣元青川縣主栽的3個油橄欖品種初榨橄欖油的 α-生育酚平均值含量(28.78 mg/100 g)，可能是橄欖油中的α-生育酚在高溫浸提花椒時發生氧化破壞，這與徐莉等[15]的研究結果一致，即α-生育酚對橄欖油的穩定性起了主要的抗氧化作用；此外，根據鄧龍[16]報道的32種市售不同品牌、產地及加工工藝的菜籽油中α-生育酚含量在73.799～271.952 mg/kg可知，菜籽油中的α-生育酚含量低于初榨橄欖油，然而YJ花椒油中的α-生育酚含量高于GL花椒油，表明菜籽油中的α-生育酚可能較橄欖油更穩定。

根據鄧龍等的報道，32種市售不同品牌、產地及加工工藝菜籽油的角鯊烯含量在1.746～31.005 mg/kg，可見橄欖油富含角鯊烯。本試驗中的4個花椒油樣品，GL角鯊烯含量最高(2912.11 mg/kg)，隨著花椒油中橄欖油比例降低，角鯊烯含量降低，9-1與GL差異不顯著(P>0.05)，而2-8、YJ中的角鯊烯含量均極顯著低于9-1與GL(P<0.01)，這與橄欖油摻入的比例有密切關系，因為橄欖油中的角鯊烯含量遠高于菜籽油。植物甾醇廣泛存在于植物油中，具有良好的抗氧化、抑菌、降低膽固醇、抗潰瘍、抗腫瘤等作用[18]。仇宏圖等報道了7組菜籽油樣品中谷甾醇含量在 351.78～608.39 mg/100 g；張東等報道了我國8個品種的初榨橄欖油的谷甾醇含量在100～300 mg/100 g；可見，菜籽油中的谷甾醇更高。由表1可知，YJ谷甾醇含量最高(26285 mg/kg)，2-8 次之(2546 mg/kg)，且均極顯著高于 GL、9-1(P<0.01)。

橄欖油中主要的多酚類化合物有沒食子酸、羥基酪醇、蘆丁、阿魏酸、槲皮素，且羥基酪醇、蘆丁、阿魏酸、槲皮素具有良好的抗氧化、抑菌、抗病毒、抗腫瘤等作用[19]。向春蓉[20]報道了四川涼山州引進的8個品種油橄欖的初榨橄欖油的總多酚含量平均值為26.04 mg/kg，其中，克羅萊卡的總多酚含量最高，為180.21 mg/kg；張亮等[21]報道了不同制油工藝制得的菜籽油的總多酚含量在47.00～152.08 mg/kg；可見，菜籽油中的總多酚含量較高。由表1可知，GL總多酚含量最高(27.56 μg/g)，隨著摻入菜籽油比例的增加，各花椒油中總多酚的含量呈降低趨勢，但均無顯著差異(P>0.01)，可能多酚對菜籽油的穩定性起了主要的抗氧化作用。黃酮是一類具有2-苯基色原酮(2-phenyl-chromones)結構的多酚類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤等生物活性。由表1可知，GL總黃酮含量最高(1.96 mg/g)，隨著摻入菜籽油比例的增加，各花椒油中總黃酮的含量呈降低趨勢，但均無顯著差異(P>0.05)。

2.1.2 橄欖花椒油體外抗氧化作用分析

抗氧化作用易受多方面因素的影響，僅憑單一的抗氧化指標評價花椒油抗氧化能力缺乏說服力，因此本試驗選擇多個不同的體外抗氧化指標對花椒油抗氧化能力進行評價。各花椒油的體外抗氧化能力的 IC50值見表2。

表2 橄欖花椒油的IC50Table 2 The IC50 values of olive Zanthoxylum oil

由表2可知，各花椒油均具有一定的體外抗氧化能力，這與李杰等的研究結果一致，然而，各花椒油的體外抗氧化 IC50值表現出較大差異，其中，各花椒油對 ABTS+·、·OH、DPPH·表現出較好的清除力，IC50值較小，而各花椒油的還原力、總抗氧化力較弱，IC50值較大。 GL清除ABTS+·的能力最強，IC50值為42.37 μg/mL，而YJ清除 ABTS+·的IC50值為57.42 μg/mL，差異不顯著(P>0.05)；GL還原力最差，IC50值為134.15 μg/mL，而YJ為153.51 μg/mL，其差異不顯著(P>0.05)。造成以上結果的原因可能與各抗氧化指標的測定原理有關，即與花椒油中的抗氧化組分的種類及含量有關。另外，由表2可知，隨著花椒油中橄欖油比例的增加，其抗氧化能力增強，GL的各抗氧化指標的IC50值均最小，其中，GL對·OH的清除力顯著優于YJ(P<0.05)。結合2.1.1對各花椒油中抗氧化組分檢測結果的分析可推知，各花椒油體外抗氧化能力的差異與花椒油中α-生育酚、角鯊烯、谷甾醇、總黃酮、總多酚等抗氧化物質的含量有關。

2.2 橄欖花椒油抑菌作用的結果分析

2.2.1 橄欖花椒油抑菌效果

(1)研究了我國煤礦安全管理制度建設的效果，將我國近30年煤礦百萬噸死亡率的發展變化劃分為制度欠缺期與制度改善期2個階段，通過直觀分析得出安全管理制度改善期的安全生產狀況明顯好于制度欠缺期，煤礦百萬噸死亡率從1984年到2016年下降了97.8%。

各花椒油對3種受試的食品常見致病菌的抑菌作用見表3。

表3 橄欖花椒油對受試菌的抑菌作用Table 3 The antibacterial effect of olive Zanthoxylum oil on tested bacteria

續 表

由表3可知，各花椒油對3種受試菌均有抑菌作用，說明花椒油具有廣泛的抑菌作用，這與前人的研究報道一致[22]；比較抑菌圈大小，各花椒油對3種受試菌的抑菌作用強度為：大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>沙門氏菌。各花椒油在不同濃度下對3種受試菌的抑菌作用存在差異，隨著花椒油濃度的增加抑菌圈直徑逐漸增大，說明花椒油對3種受試菌存在量效關系，其中，在4個花椒油中濃度為 8 mg/mL的花椒油與對照組差異均極顯著(P<0.05)，以上研究結果與趙二勞等的報道一致。

此外，隨著花椒油中橄欖油比例的增加，花椒油對3種受試菌的抑菌作用增強；比較抑菌圈大小，GL的抑菌作用最好，9-1次之，YJ的抑菌作用最差。可見，橄欖油有助于提高花椒油的抑菌作用，這與橄欖油中酚類化合物的含量及種類有關。橄欖油中的酚類化合物(橄欖苦苷苷元脫羧甲基、羥基酪醇和酪醇的二醛結構)已被證明在體外對3種食源性致病菌(大腸桿菌 O157∶H7、李斯特菌和沙門氏菌)具有抗菌作用，并且橄欖油中各種酚類化合物之間具有協同相互作用[23]。本試驗中，各濃度的9-1花椒油對大腸桿菌的抑菌圈直徑均大于同濃度GL花椒油，這可能與橄欖油、菜籽油以及花椒本身含有的酚類化合物的協同作用有關；另外，1.0 mg/mL 9-1 花椒油對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大于同濃度GL花椒油，1.0，2.0，4.0 mg/mL的9-1花椒油對沙門氏菌的抑菌圈直徑大于同濃度GL花椒油。

2.2.2 橄欖花椒油的最低抑菌濃度

各花椒油對 3 種受試菌的最小抑菌濃度(MIC)見表4。

表4 橄欖花椒油的最低抑菌質量濃度Table 4 The minimum inhibitory mass concentration of olive Zanthoxylum oil

由表4可知，GL對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的MIC分別是 0.250，0.500，1.000 mg/mL，9-1對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的 MIC 分別是 0.250，0.500，1.000 mg/mL，2-8對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的MIC分別是0.500，0.500，1.000 mg/mL，YJ對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的MIC分別是0.500，0.500，1.000 mg/mL。MIC越小說明樣品的抑菌作用越強，抑菌效果越好。

2.3 橄欖花椒油加速氧化過程中的酸值、過氧化值分析

酸值、過氧化值常用來描述油樣在加速氧化過程中的氧化動力學特征[24]。根據NY/T 2111-2011 《綠色食品 調味油》的規定，花椒油(即香辛料調味油)的酸值不能超過 3 mg/g(以KOH計)，過氧化值不能超過 7.5 mmol/kg。

表5 橄欖花椒油的酸值(以KOH計)Table 5 The acid values of olive Zanthoxylum oil (calculated by KOH)

由表5可知，各花椒油的初始酸值在0.90～1.19 mg/g之間，其GL花椒油最低，YJ花椒油最高，但均未超過3 mg/g，由此可見，花椒浸提用油對花椒油的酸值有影響，純橄欖油用于花椒油生產有利于降低其初始酸值，這可能是因為橄欖油中游離脂肪酸較少。各花椒油在(60±1) ℃恒溫烘箱內進行加速氧化，隨著加速氧化時間的延長，GL 花椒油、9-1花椒油的酸值呈逐步上升趨勢，而YJ花椒油、2-8花椒油呈波動性上升趨勢，整個加速氧化過程中，各花椒油的酸值均未超過NY/T 2111-2011 《綠色食品 調味油》的規定。

表6 橄欖花椒油的過氧化值Table 6 The peroxide values of olive Zanthoxylum oil

由表6可知，第0天的GL花椒油、9-1花椒油的過氧化值均超過 7.50 mmol/kg，即超出NY/T 2111-2011《綠色食品 調味油》的規定，且 GL花椒油的過氧化值最高(9.67 mmol/kg)，極顯著高于YJ花椒油(P<0.01)，顯著高于2-8花椒油(P<0.05)；而第0天的YJ花椒油、2-8花椒油的過氧化值均小于 7.50 mmol/kg，即符合NY/T 2111-2011《綠色食品 調味油》的規定。以上結果表明，純橄欖油用于花椒油的生產升高了花椒油的過氧化值；而純菜籽油用于花椒油的生產有利于降低花椒油的過氧化值，這可能是因為橄欖油中不飽和脂肪酸含量較高。隨著加速氧化時間的延長，各花椒油的過氧化值迅速升高，其中第12天的GL花椒油的過氧化值顯著高于第0天的GL花椒油(P<0.05)，第12天、第30天的YJ 花椒油的過氧化值極顯著高于第0天的YJ花椒油(P<0.01)，第12天的9-1花椒油的過氧化值極顯著高于第0天的9-1花椒油(P<0.01)，第12天的2-8 花椒油的過氧化值極顯著高于第0天的2-8花椒油(P<0.01)。加速氧化第12天時，各花椒油的過氧化值達到最高峰，隨后下降再升高，第30天時，各花椒油的過氧化值又達到一個高峰，這可能是橄欖油及菜籽油本身的化學性質和化學組分影響花椒油的氧化穩定性，比如橄欖油中的β-胡蘿卜素、植物多酚類等。

綜上，用于花椒油生產的植物油種類對花椒油的氧化穩定性有顯著的影響。以上結果顯示，菜籽花椒油抵御自動氧化的能力較好，而橄欖花椒油抵御自動氧化的能力較差；油脂抵御自動氧化的能力反映了油脂的耐貯性[25]，即菜籽花椒油較橄欖花椒油更耐貯藏。

3 結論

本試驗采用(調和)橄欖油浸提花椒制備調味花椒油，并對其抗氧化組分進行了測定，結果發現純橄欖花椒油中的角鯊烯、總黃酮、總多酚含量最高，且角鯊烯含量極顯著高于純菜籽花椒油(P<0.01)、摻入20%橄欖油的花椒油(P<0.01)，而總黃酮、總多酚含量與純菜籽花椒油、摻入20%橄欖油的花椒油的差異均不顯著(P>0.05)。此外，純菜籽花椒油中的α-生育酚含量最高，與摻入90%橄欖油花椒油的差異顯著(P<0.05)；谷甾醇含量與純橄欖花椒油、摻入90%橄欖油的花椒油差異均極顯著(P<0.01)。應用 ·OH 清除力、ABTS+· 清除力、DPPH· 清除力、總抗氧化力、還原力評價橄欖花椒油的體外抗氧化作用，最終發現橄欖油能增強花椒油的抗氧化作用，制備花椒油的橄欖油比例越高，抗氧化作用越強；其中，純橄欖花椒油與純菜籽花椒油對·OH的清除力差異顯著(P<0.05)，其他各組之間均不存在統計學意義(P>0.05)。通過測定花椒油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的抑菌效果，發現花椒油對受試3種食品常見致病菌均有抑制作用，摻入橄欖油的花椒油的抑菌效果優于純菜籽花椒油；其中，純橄欖花椒油與摻入90%橄欖油的花椒油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的 MIC 相同，分別是 0.250，0.500，1.000 mg/mL，然而摻入90%橄欖油的花椒油對受試3種菌的抑菌圈卻大于純橄欖花椒油。通過氧化加速試驗檢驗純橄欖花椒油、摻入90%橄欖油的花椒油以及摻入20%橄欖油的花椒油的貯藏性，并以純菜籽花椒油作為陽性對照，結果發現，各橄欖花椒油的酸值與純菜籽花椒油差異不顯著(P>0.05)，然而，純橄欖花椒油的過氧化值極顯著高于純菜籽花椒油(P<0.01)，顯著高于摻入20%橄欖油的花椒油(P<0.05)，且第0天的純橄欖花椒油、摻入90%橄欖油的花椒油的過氧化值均超出NY/T 2111-2011《綠色食品 調味油》的規定。綜上，本研究結果表明采用橄欖油作為花椒油浸提用油能提升花椒油的抗氧化、抑菌作用，但是，橄欖油會降低花椒油的氧化穩定性，即降低花椒油的貯藏性。因此，從生產成本、產品風味、貯藏特性、抗氧化及抑菌作用等方面綜合考慮，建議花椒油中摻入10%橄欖油。