醬油曲中谷氨酰胺酶酶學特性研究

孫啟星，曾小波，李學偉，朱新貴

(李錦記(新會)食品有限公司，廣東 江門 529100)

醬油中的鮮味成分主要來源于大豆蛋白經微生物酶解之后形成的氨基酸、多肽類物質，而呈鮮味的氨基酸主要是谷氨酸。大豆蛋白中含有約16%谷氨酸，其中約46%谷氨酸以谷氨酰胺的形式存在[1]。谷氨酰胺不具有鮮味，其在谷氨酰胺酶的作用下可轉化為谷氨酸和氨[2-3]，因此研究谷氨酰胺酶提高醬油的鮮味具有重要意義。

米曲霉產谷氨酰胺酶方面的研究已有較多報道，周其洋等[4]通過ARTP誘變技術使米曲霉產谷氨酰胺酶活力提高25%；馬永強等[5]通過優化制曲工藝，使曲料中谷氨酰胺酶酶活力達到2.2 U/g；鄒敏娟[6]利用谷氨酸快速檢測試劑盒建立了曲料中谷氨酰胺酶檢測方法。關于其他微生物產谷氨酰胺酶酶學性質分析也有較多研究，如解淀粉芽孢桿菌[7]、枯草芽孢桿菌等[8]，而關于米曲霉的研究較少。

本文以醬油曲中谷氨酰胺酶為研究對象，通過研究不同的溫度、pH、NaCl和底物對谷氨酰胺酶酶活力的影響，分析其酶學特性，為提高醬油中谷氨酸含量提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

種曲：李錦記(新會)食品有限公司自制；黃豆、面粉：均為市購。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸、氧化鎂、氯化鈉、谷氨酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、乙酸：均為分析純，廣州化學試劑廠；L-谷氨酰胺、天冬酰胺：色譜純。

BBI Life Sciences AL204型分析天平、FE28臺式pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；磁力攪拌水浴鍋 常州金壇良友儀器有限公司；Kjeltec KT200福斯全自動定氮儀 福斯分析儀器公司；MGC-400H人工氣候培養箱、HWS-26恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌器 日本ALP株式會社；冰箱 海爾集團；電位滴定儀 瑞士萬通(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 成曲制備

黃豆加水浸泡3 h后，在121 ℃下蒸煮20 min，冷卻降溫至30～35 ℃，與面粉混合拌料，黃豆和面粉的比例為7∶3，同時接入3‰種曲，混合均勻后在30 ℃，濕度96%條件下培養，在培養時間17，25 h進行松曲，48 h出曲，即為醬油成曲。

1.2.2 溫度對谷氨酰胺酶活力的影響

溫度對酶活力的影響：曲料用不同溫度的磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)打漿后，分別在相對應溫度30，40，50，55，60，65 ℃條件下檢測谷氨酰胺酶酶活。

谷氨酰胺酶熱穩定性：曲料用磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)打漿后，分別置于30，40，55，65 ℃水浴鍋中保溫，每隔2 h取樣檢測谷氨酰胺酶酶活。

1.2.3 pH對谷氨酰胺酶活力的影響

pH對酶活力的影響：采用不同pH值(4，5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9)緩沖液打漿后，在37 ℃條件下檢測谷氨酰胺酶酶活。

谷氨酰胺酶pH穩定性：將不同pH值(6，7，8，9)的緩沖液預冷至4 ℃，分別與曲料打漿后，放置在4 ℃冰箱中，每隔3 h取樣檢測谷氨酰胺酶酶活。

1.2.4 NaCl對谷氨酰胺酶活力的影響

NaCl對酶活力的影響：用pH 7.2磷酸鹽緩沖液配制不同濃度的食鹽水2%、6%、10%、15%、18%，與曲料打漿后，在37 ℃條件下檢測谷氨酰胺酶酶活。

谷氨酰胺酶NaCl穩定性：用pH 7.2磷酸鹽緩沖液配制不同濃度的食鹽水0%、2%、6%、10%，預冷卻至4 ℃，分別與曲料打漿后，放置于4 ℃冰箱中，每隔1 h取樣檢測谷氨酰胺酶酶活。

1.2.5 谷氨酰胺酶底物專一性和底物抑制作用

底物專一性：用天冬酰胺代替谷氨酰胺，其他同1.3酶活力檢測方法。

底物抑制作用：用pH 7.2磷酸鹽緩沖液配制不同濃度的味精20，60，100 g/L，與曲料打漿后，在37 ℃條件下檢測谷氨酰胺酶酶活。

1.3 酶活力檢測方法

10 g曲料加40 g磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)后打漿粉碎，取漿液35 g，加入0.5 g谷氨酰胺，37 ℃磁力攪拌反應1 h，反應結束后立即添加3 g TCA溶液(20%)終止反應，空白先添加TCA溶液后再添加谷氨酰胺反應；取10 g反應液檢測氨含量[9]，氨的檢測方法參照GB 5009.234-2016。

谷氨酰胺酶活力定義：在37 ℃、pH 7.2的反應條件下，每1 min水解谷氨酰胺產生1 μmol NH3定義為1個酶活單位。

2 結果與分析

2.1 溫度對谷氨酰胺酶酶活力及穩定性的影響

根據1.3酶活力檢測方法，在不同溫度反應體系中保溫1 h檢測酶活力，結果見圖1。

圖1 溫度對谷氨酰胺酶活力的影響Fig.1 Effect of temperature on the activity of glutaminase

由圖1可知，隨著反應溫度的升高，酶活力呈線性上升，在55 ℃達到最高酶活力4.4 U，這與梁天一等[10]從枯草芽孢桿菌中分離的谷氨酰胺酶的最適反應溫度一致，但是與鄒敏娟等研究表明醬油曲中最適反應溫度37 ℃不同，可能是曲霉所產谷氨酰胺酶結構不同導致的。當溫度大于55 ℃時，酶活力快速下降，溫度對酶活力的影響較大。

溫度除了影響酶活力外，對酶的穩定性也有較大的影響，不同溫度對谷氨酰胺酶熱穩定性的影響見圖2。

圖2 谷氨酰胺酶熱穩定性Fig.2 Effect of temperature on the stability of glutaminase

由圖2可知，在同一溫度條件下，隨著時間的延長，酶活力逐漸下降，溫度越高酶活力下降越快。55 ℃條件下維持8 h后，酶活力僅為初始酶活的30%，酶活損失嚴重。因此，谷氨酰胺酶酶解過程中應同時考慮溫度對酶活力和熱穩定性的影響，提高底物的轉化率。

2.2 pH對谷氨酰胺酶酶活力及穩定性的影響

反應體系過酸或過堿均會影響蛋白酶結構，進而降低蛋白酶的活性。本文分析了不同pH值對谷氨酰胺酶活力的影響，見圖3。

圖3 pH對谷氨酰胺酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of glutaminase

由圖3可知，最適反應pH值在7.0～7.5之間，超過此范圍，酶活急劇下降，直至失活。目前已有報道的產谷氨酰胺酶微生物中，解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和米曲霉所產谷氨酰胺酶最適pH在7.0左右，而檸檬酸細菌和酵母菌屬產谷氨酰胺酶最適pH偏酸性，這與微生物本身的特性有關。

通過不同pH值緩沖液維持相應pH，將其放置在4 ℃條件下，間斷取樣檢測酶活，分析谷氨酰胺酶在不同pH條件下的穩定性，結果見圖4。

圖4 谷氨酰胺酶pH穩定性Fig.4 Effect of pH on the stability of glutaminase

不同的pH條件下，酶活的下降趨勢基本一致，即不同pH條件對酶活穩定性無明顯差異，該現象優于溫度對酶活穩定性的影響。米曲霉產谷氨酰胺酶在pH 6.0～9.0范圍內均能保持較高活性，這與解淀粉芽孢桿菌產谷氨酰胺酶pH穩定性一致，比酵母產谷氨酰胺酶范圍更廣泛，酵母產谷氨酰胺酶在酸性條件下較穩定，當pH高于4.5時，酶穩定性開始快速下降[11]。

2.3 NaCl對谷氨酰胺酶酶活力及穩定性的影響

醬油釀造常分為高鹽稀態和低鹽固態兩種發酵工藝，均為高鹽環境，即使是低鹽固態發酵，其NaCl含量也在10%以上，因此谷氨酰胺酶必須具有一定的耐鹽性，才能發揮其活力。不同濃度NaCl下谷氨酰胺酶酶活力的變化趨勢見圖5。

圖5 NaCl對谷氨酰胺酶活力的影響Fig.5 Effect of NaCl on the activity of glutaminase

由圖5可知，隨著NaCl濃度的提高，酶活力急劇下降，在15% NaCl濃度下，酶活力基本為0；在6% NaCl條件下，酶活力損失70%以上；在10% NaCl力的條件下，酶活力僅剩余約15%，NaCl對谷氨酰胺酶活性影響顯著。盧慧茵等對解淀粉芽孢桿菌產谷氨酰胺酶耐鹽性研究表明，在15% NaCl濃度時仍能保持70%以上相對酶活，這可能與不同微生物所產谷氨酰胺酶的結構有關。Yoshimune等研究證明，當NaCl的濃度超過1.7 mol/L時，谷氨酰胺酶C端片段會發生構型變化，從而使谷氨酰胺酶具有一定的耐鹽性[12-13]。

圖6 谷氨酰胺酶NaCl穩定性Fig.6 Effect of NaCl on the stability of glutaminase

對不同NaCl濃度條件下的酶活穩定性進行分析(見圖6)，NaCl的濃度越高，酶失活的速度越快。在6% NaCl體系中維持4 h，酶活力全部失活，而在10% NaCl體系中僅能存放2.5 h。即使在較低NaCl條件下(2%)，維持5 h后，蛋白酶失活70%以上，并且隨著時間的延長繼續降低，這表明米曲霉產谷氨酰胺酶幾乎不耐鹽。

2.4 谷氨酰胺酶底物專一性及底物抑制作用

呈鮮味的氨基酸主要為谷氨酸和天冬氨酸，這兩種氨基酸都能以酰胺形式存在，必須脫酰胺后才能呈現出鮮味，因此本文分析了谷氨酰胺酶對天冬酰胺的作用。

表1 谷氨酰胺酶底物專一性及底物抑制性Table 1 The specificity and inhibition ability of glutaminase substrate

由表1可知，谷氨酰胺酶對天冬酰胺也有活性，其酶活為谷氨酰胺底物的50%，這說明谷氨酰胺酶為非專一性蛋白酶，這與韓銘海等[14]的研究結果一致。

谷氨酸濃度對谷氨酰胺酶的抑制作用也是限制體系谷氨酸含量提高的影響因素。不同濃度谷氨酸條件下谷氨酰胺酶活力見表1，結果表明，在100 g/L谷氨酸條件下，酶活力無抑制作用，即在一定濃度條件下，谷氨酰胺酶無產物抑制作用。

3 結論

本文從溫度、pH、鹽含量、底物專一性和底物抑制作用5個因素出發，深入分析了醬油曲中谷氨酰胺酶酶活特性，研究結果表明，米曲霉產谷氨酰胺酶最適溫度為55 ℃，熱穩定性較差，在最適溫度下維持8 h，酶活力損失70%以上，并且隨著時間的延長繼續下降；最適pH為7.0，在pH 6.0～9.0范圍內均能維持較高的活性，酶活力下降速度較慢；谷氨酰胺酶耐鹽性較差，在6% NaCl條件下，酶活力失活70%以上，在15% NaCl時，酶活力幾乎為0；在耐鹽性方面，在6% NaCl體系中維持4 h，酶活力全部失活，即使在2% NaCl條件下維持5 h后，酶活力損失70%以上，并隨著時間的延長繼續降低，這說明米曲霉產谷氨酰胺酶幾乎沒有耐鹽性，通過提高米曲霉谷氨酰胺酶活力提升谷氨酸含量的方案從理論上是不可行的。谷氨酰胺的脫酰胺過程，可以通過額外添加耐鹽性谷氨酰胺酶或者在發酵過程中添加能夠合成耐鹽性谷氨酰胺酶的微生物實現。研究結果還表明，谷氨酰胺酶也可以將天冬酰胺轉化為天冬氨酸，其轉化效率僅為谷氨酰胺的一半，并且高濃度谷氨酸對谷氨酰胺酶無底物抑制作用。本研究結果旨在為醬油中谷氨酸含量的提升提供一定的理論指導。