高氯酸非水滴定法測定醬油中氨基酸態氮含量可行性研究

汪靜靜，周小清

(泰州市藥品檢驗院，江蘇 泰州 225300)

醬油是中國傳統的調味品。氨基酸態氮是醬油發酵程度的特性指標，也是影響醬油風味的重要因素。因此一定程度上，醬油中氨基酸態氮含量決定該醬油的質量等級[1]。國家強制標準[2]規定最低等級醬油中氨基酸態氮含量不得低于0.40 g/mL。因此，企業也在不斷改善醬油中發酵工藝以獲取高含量的氨基酸態氮，從而提高其商業價值。由于釀造工藝直接影響醬油中氨基酸的含量[3-7]，方便快捷、精確的氨基酸態氮測定方法對生產企業過程控制尤其重要。

目前醬油中氨基酸態氮的檢測方法主要是依據國標GB 5009.235-2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定》[8]中酸度計法和分光光度計法兩種方法，其中酸度計法為仲裁法且最常用[9-10]，具體操作步驟：樣品溶液先用氫氧化鈉標準溶液滴定至酸度計指示pH 8.2，記下消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數，再加入甲醛以固定氨基酸中氨基的堿性，使羧基表現出酸性，再繼續用氫氧化鈉標準溶液滴定，以酸度計指示pH 9.2確定終點。整個過程操作相對繁瑣，影響測定結果準確性的因素較多[11-12]，且甲醛對皮膚黏膜有刺激作用[13-15]。

考慮到高氯酸作為含氧酸中最強酸，通常用于有機堿類物質含量的滴定[16-19]，而氨基酸本身亦屬于有機堿類物質，理論上可以用高氯酸滴定。另外，現行GB 5009.43-2016《食品安全國家標準 味精中麩氨酸鈉(谷氨酸鈉)的測定》中新增加了高氯酸非水溶液滴定法測定味精中的谷氨酸鈉，更是給了我們建立高氯酸非水溶液滴定法測定醬油中氨基酸態氮含量的信心。

本文利用氨基酸的兩性作用，采用乙酸酐-乙酸體系溶解醬油，使醬油中氨基酸在乙酸酐-乙酸體系中酸性減弱而堿性大大提高，考察高氯酸標準滴定液滴定其氨基的可行性并建立初步方法?？疾炝嗽摲椒ǖ闹貜托约凹訕嘶厥章?，并將該方法和酸度計法進行對比研究，以期為醬油生產和質量控制提供更多的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醬油：購于本地超市；醬油標準品：大連中實國實檢測技術有限公司，含量為1.15 g/100 g；氫氧化鈉標準溶液[C(NaOH)=0.0501 mol/L]；高氯酸標準溶液[C(HClO4)=0.1044 mol/L]。甲醛36%、醋酸、醋酸酐：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為蒸餾水。

XS204電子分析天平、梅特勒托利多儀器公司；FE20酸度計 梅特勒-托利多儀器公司；C-MAG-HS7磁力加熱攪拌器 IKA儀器公司；888全自動電位滴定儀+復合玻璃pH智能電極 瑞士萬通公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 儀器方法

空白測定采用等量滴定模式，最小加液體積為0.01 mL。樣品測定采用等量滴定模式；加液速度為5 mL/min，攪拌速度為8 r/s，預攪拌時間為30 s，可接受信號漂移為50.0 mV/min。

1.2.2 樣品測定

準確稱取約0.5 g樣品于滴定杯中，加2 mL醋酐和60 mL冰醋酸，放置自動電位滴定儀上，插入電極和滴定管，使電極隔膜完全浸沒到被滴定的溶液中，打開電極上部的密封塞，啟動滴定方法，用高氯酸標準滴定溶液進行滴定，以電位值為縱坐標，滴定時消耗高氯酸標準滴定溶液的體積為橫坐標，儀器自動繪制電位值-滴定體積實時變化曲線，曲線明顯突躍點為其滴定終點，記錄該點所對應的消耗高氯酸標準滴定溶液的體積(V1)。試劑空白實驗取2 mL醋酐和60 mL乙酸，記錄消耗高氯酸標準滴定溶液的體積(V0)。結果計算見下式：

式中：X為樣品中氨基酸態氮的含量(g/100 g)；V1為測定用試樣消耗高氯酸標準滴定溶液的體積(mL)；V2為試劑空白試驗消耗高氯酸標準滴定溶液的體積(mL)；C為溫度校準后高氯酸標準滴定溶液的濃度(mol/L)；0.007為與1.00 mL高氯酸標準滴定溶液[C(HClO4)=1.000 mol/L]相當的氮的質量(g)；m為稱取試樣的質量(g)；100為單位換算系數。

2 結果與分析

2.1 樣品水分去除

水溶液體系通過影響有機堿的堿性從而影響非水滴定的靈敏度，醬油中水分含量在50%左右，因此選擇合適的水分去除方法是本次可行性研究的關鍵之一。本文首先考察了物理烘干和在溶解過程中加入醋酐兩種方式，結果表明，醬油樣品經過烘干后呈現粘稠膠質狀態，在醋酸中溶解困難，滴定曲線雜亂無規律，因此放棄物理烘干。醋酐常用于非水滴定實驗以除去樣品和醋酸中水分，醋酐的加入量也會對滴定突躍產生一定的影響，因此對醋酐的加入體積進行了考察。醬油配方中水分約為52%～53%[20]，每1 g水能與5.22 mL醋酐定量反應，本方法中醬油取樣量為0.5 g，約需要1.305～1.383 mL醋酐，所用醋酸試劑含水量約為0.2%，用量為60 mL，比重為1.05 g/mL，需消耗0.117 mL比重1.08 g/mL含量97.0%的醋酐，綜上可知，待滴定試液理論上需要約1.5 mL醋酐去除水分。依據該理論值進行優化實驗，各取0.5 g醬油，分別加入醋酐0，1，1.5，2，2.5，3，5，10 mL，均加入60 mL冰醋酸進行測定。結果顯示：隨著酸酐加入量增大，滴定終點會稍微提前，經過與酸度計法結果比較發現，加入酸酐1 mL時氨基酸態氮含量與酸度計法結果無顯著差異。加入1 mL酸酐的典型滴定曲線圖見圖1。

圖1 全自動電位滴定圖Fig.1 The diagram of automatic potentiometric titration

2.2 考察方法重復性

按1.2實驗方法對樣品平行測定6次，考察了方法重復性，并將結果與國標中酸度計法進行對比，結果見表1。電位滴定法和酸度計法相對標準偏差RSD分別為0.16%和0.15%，表明電位滴定法與酸度計法都具有良好的重復性，測定含量與酸度計法進行比較結果無顯著差異(P>0.05)。

表1 方法重復性Table 1 The precision of the method

2.3 考察方法回收率

準確稱取約0.5 g醬油標準品于100 mL容量瓶中，用乙酸定容，搖勻。對于一固定的醬油樣品，分別加入2.5，5.0，7.5 mL醬油標準品，乙酸溶液總體積保持60 mL，按照1.2的方法操作，測定回收率，每個濃度平行3次，結果見表2，回收率在94.87%～97.92%之間。

表2 電位滴定法測定醬油中氨基酸態氮的回收率(n=3)Table 2 The recovery rates of amino acid nitrogen in soy sauce determined by potentiometric titration method (n=3)

2.4 樣品檢測

分別用本文所建立的非水滴定法和國標酸度計法對6種不同氨基酸態氮含量水平的醬油進行檢測，并將檢測結果進行比對，見表3，結果顯示無顯著差異。

表3 兩種方法測定不同樣品氨基酸態氮含量Table 3 The amino acid nitrogen content in different samples by two methods

3 討論與結論

醬油成分復雜，其中氨基酸種類繁多，每種氨基酸是否能充分被滴定以及醬油發酵過程中是否產生其他有機堿參與滴定仍待進一步研究確證。由目前結論可知，本文考察的高氯酸非水滴定法測定醬油中氨基酸態氮含量具有一定可行性，初步建立的高氯酸非水滴定法具有操作簡單、重現性好、結果準確度高等優點，為醬油中氨基酸態氮的測定提供了更多可能性，具有廣闊的研究及應用前景。