血管軟化丸調(diào)控miRNA-155防治動脈粥樣硬化的機制

聶 勇，秦合偉，呂 哲，姬令山，李文濤

(1.駐馬店市中醫(yī)院，河南 駐馬店 463000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450002)

動脈粥樣硬化(athcrosclerosis，AS)是缺血性心腦血管疾病的基本病理基礎(chǔ)，脂質(zhì)代謝紊亂、血液流變性異常和炎癥反應(yīng)是促使AS形成的重要危險因素。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在調(diào)節(jié)AS發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，miRNA-155(miR-155)是非編碼的微小RNA之一，其可表達于活化的免疫細胞，并與免疫功能相關(guān)，而單核巨噬細胞、內(nèi)皮細胞及血管平滑肌細胞也參與了AS形成過程。此外，miR-155調(diào)控炎癥反應(yīng)防治AS與調(diào)控細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)/磷酸化轉(zhuǎn)錄激活子3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3)炎癥信號通路，進而影響程序性細胞凋亡因子4(programmed cell death 4，PDCD4)表達，以及影響腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白細胞介素-6(nterleukin-6，IL-6)、干擾素-γ(interferon gamma，IFN-γ)3種炎癥因子水平有關(guān)。本實驗通過觀察血管軟化丸對miR-155和SOCS1/p-STAT3/PDCD4炎癥信號通路的調(diào)控，以及對TNF-α、IL-6、IFN-γ等炎癥因子的影響，探究其抗AS的作用機制。

1 材料和方法

1.1 體內(nèi)實驗

1.1.1 實驗動物 ApoE小鼠60只，SPF級，8周齡，體質(zhì)量(18±2)g，購自南京大學(xué)模式動物研究所[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2015-0001]。RAW264.7小鼠巨噬細胞株購自ATCC。將所有動物飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院動物實驗中心，(22±1)℃恒溫，60%～75%恒濕，12 h循環(huán)照明，自由攝食、飲水。本實驗已通過河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會審查，倫理審查批準文號為20170228。

1.1.2 藥物與試劑 血管軟化丸組方：黃芪30 g，山楂20 g，萊菔子15 g，丹參、三七、陳皮各12 g，清半夏10 g，甘草6 g。所有中藥飲片均來自河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，由醫(yī)院煎藥房按照要求，煎煮和濃縮成3.456、0.864 g/mL的湯劑。熒光定量PCR試劑盒(00382278)：TaKaRa公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Cat 638313)：Fermentas公司；蛋白提取試劑盒(P0011)：碧云天公司；抗體miR-155(Ab139805)、SOCS1(bs-4615R)、p-STAT3(10931)、PDCD4(F0413)和GAPDH(112438)：Cell Signaling公司；二抗(羊抗小鼠IG-HRP，ab97023)：武漢博士德生物工程有限公司；鼠TNF-α ELISA試劑盒(1403045)、鼠IL-6 ELISA試劑盒(1403079)、鼠IFN-γ ELISA試劑盒(1403026)：武漢博士德生物工程有限公司；Anti-miR-155：由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計和合成。

1.1.3 模型復(fù)制與動物分組 所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，各組均予以自由飲水，ApoE小鼠給予全程高脂飼料(含脂肪21%、膽固醇0.15%)喂養(yǎng)，高脂飼料飼養(yǎng)8周，以復(fù)制AS模型。模型復(fù)制成功(小鼠主動脈壁可見明顯的斑塊形成)后將60只ApoE小鼠隨機分為5組，每組12只，均持續(xù)給藥8周。①模型組：ApoE小鼠全程高脂飼養(yǎng)，不進行任何干預(yù)。②miR-155抑制劑組：尾靜脈注射miR-155抑制劑，按30 mg/(kg·d)注射，每周1次，連續(xù)注射8周，期間給予高脂飼料。③miR-155模擬物組：尾靜脈注射miR-155模擬物，按30 mg/(kg·d)注射，每周1次，連續(xù)注射8周，期間給予高脂飼料。④血管軟化丸高劑量組：給予相當(dāng)于70 kg成人12倍劑量[86.4 g/(kg·d)]的血管軟化丸，連續(xù)干預(yù)8周，期間給予高脂飼料。⑤血管軟化丸低劑量組：給予血管軟化丸21.6 g/(kg·d)，連續(xù)干預(yù)8周，期間給予高脂飼料。

1.1.4 樣品采集和病理形態(tài)學(xué)觀察 藥物干預(yù)8周后，頸椎脫臼法處死小鼠，沿主動脈瓣至髂動脈分支處剝離全長主動脈，選取近主動脈瓣附近主動脈壁，一部分固定于4%甲醛溶液中，用于蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色；一部分置于-80 ℃冰箱凍存，用于分子生物學(xué)等檢測。

1.1.5 qRT-PCR檢測各組小鼠主動脈miR-155、SOCS1、p-STAT3、PDCD4 mRNA表達水平 將小鼠主動脈組織稱取質(zhì)量后，加入適量Trizol，按試劑盒說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，采用SYBR Green進行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，40個循環(huán)，采用2-ΔΔC法計算目的基因的表達水平。以GAPDH為內(nèi)參，基因引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.1.6 ELISA法檢測小鼠血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ水平 采集小鼠血漿，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作方法檢測血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ水平。

1.2 體外實驗

1.2.1 含藥血清制備和細胞分組 將20只雄性健康SD大鼠[體質(zhì)量(300±20)g，購自南京大學(xué)模式動物研究所]隨機分為中藥組和對照組。中藥組給予高劑量[86.4 g/(kg·d)]血管軟化丸，對照組灌胃給予等量生理鹽水，每日早晚各1次，連續(xù)5 d。末次給藥后1 h，腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，腹主動脈取血，分離血清，離心，過濾除菌，分裝備用。采用ox-LDL刺激RAW264.7巨噬細胞建立模型，以每孔1×10/mL將細胞鋪板于24孔板，分別加入5、10、20 μg/mL ox-LDL處理24 h。模型復(fù)制后按照干預(yù)方法分為4組。①對照組：對照組大鼠血清(RPMI 1640完全培養(yǎng)基)；②miR-155抑制劑組：模型復(fù)制后，參照脂質(zhì)體2 000說明書將miR-155抑制劑轉(zhuǎn)染至RAW264.7細胞；③miR-155模擬物組：將miR-155模擬物轉(zhuǎn)染至RAW264.7細胞；④血管軟化丸含藥血清組：模型復(fù)制后采用血管軟化丸含藥血清干預(yù)。

1.2.2 血清干預(yù)和細胞轉(zhuǎn)染實驗

(1)含藥血清作用于RAW264.7細胞 將第3～5代RAW264.7細胞棄去培養(yǎng)基，用PBS溫和洗3遍，在37 ℃、5% CO孵箱中培養(yǎng)16 h，待鋪板率達50%，棄去培養(yǎng)基，分別加入血管軟化丸不同濃度(6.25、12.5、25 μg/mL)含藥血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，最終選取血管軟化丸25 μg/mL含藥血清培養(yǎng)基干預(yù)，對照組給予空白血清完全培養(yǎng)基干預(yù)，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。

(2)細胞轉(zhuǎn)染實驗 按照文獻[4]方法轉(zhuǎn)染細胞。在無菌條件下，用含有10% FBS的細胞培養(yǎng)基DMEM，將RAW264.7細胞(1×10/mL)接種于6孔板，于37 ℃、5% CO細胞培養(yǎng)箱中孵育，備用。取miR-155抑制劑或miR-155模擬物(20 μmol/L) 6 μL和HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑12 μL，滴入300 μL細胞培養(yǎng)基DMEM，使其終濃度為5 nmol/L。室溫下，放置5～10 min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物分別均勻滴入上述接種細胞培養(yǎng)基中，待融合度約達到80%時，終止培養(yǎng)，刮取細胞，提取細胞RNA。

1.2.3 RT-PCR檢測RAW264.7細胞中miR-155、SOCS1、p-STAT3、PDCD4 mRNA表達水平 收集RAW264.7細胞，分離提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Green進行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔC法計算樣本中目的基因表達水平。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 飼養(yǎng)和給藥過程中，各組小鼠因撕咬致死1只，因灌胃致死1只，剔除離群值3只，最后進入統(tǒng)計的各組小鼠數(shù)量各為11只。

2.2 各組小鼠主動脈的組織形態(tài)學(xué)變化 模型組小鼠主動脈管徑厚薄不均勻，內(nèi)膜不光滑，管壁細胞分布不整齊，有較小的AS斑塊。miR-155抑制劑組小鼠血管管徑厚薄不均勻，斑塊形成明顯，內(nèi)皮下大量泡沫細胞形成，可見膽固醇結(jié)晶；AS斑塊可見染色較淺的無定形物、鈣化顆粒物，AS斑塊截面積顯著大于其他各組。miR-155模擬物組和血管軟化丸含藥血清組小鼠主動脈各層結(jié)構(gòu)清晰，血管細胞排列較整齊，病變程度明顯輕于模型組。見圖1。

圖1 各組小鼠主動脈的組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色，10×20倍)

2.3 各組小鼠主動脈miR-155、SOCS1、p-STAT3、PDCD4 mRNA表達水平比較 與模型組比較，miR-155抑制劑組小鼠主動脈miR-155和SOCS1 mRNA表達水平明顯降低(

P

<0.05)，miR-155模擬物組和血管軟化丸高、低劑量組主動脈miR-155和SOCS1 mRNA表達水平明顯升高(

P

<0.05)。與模型組比較，miR-155抑制劑組小鼠主動脈p-STAT3和PDCD4 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)，miR-155模擬物組和血管軟化丸高、低劑量組p-STAT3和PDCD4 mRNA表達水平明顯降低(

P

<0.05)。血管軟化丸高、低劑量組小鼠主動脈miR-155、SOCS1、p-STAT3、PDCD4 mRNA表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠主動脈miR-155、SOCS1、p-STAT3、PDCD4 mRNA相對表達水平比較

2.4 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ水平比較 與模型組比較，miR-155抑制劑組小鼠血清TNF-α、IL-6、IFN-γ水平明顯升高(

P

<0.05)，miR-155模擬物組和血管軟化丸高、低劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6、IFN-γ水平明顯降低(

P

<0.05)；血管軟化丸高、低劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6、IFN-γ水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。見表3。2.5 血管軟化丸含藥血清對RAW264.7細胞中miR-155、SOCS1、p-STAT3、PDCD4 mRNA表達水平的影響 與對照組比較，miR-155抑制劑組RAW264.7細胞中miR-155和SOCS1 mRNA表達水平明顯降低(

P

<0.05)，p-STAT3和PDCD4 mRNA表達水平明顯升高(

P

<0.05)，miR-155模擬物組和血管軟化丸含藥血清組RAW264.7細胞中miR-155和SOCS1 mRNA表達水平明顯升高(

P

<0.05)，p-STAT3和PDCD4 mRNA表達水平明顯降低(

P

<0.05)。見表4。

表3 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ水平比較

表4 含藥血清對RAW264.7細胞中miR-155、SOCS1、p-STAT3、PDCD4 mRNA表達水平的影響

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可表達于活化的免疫細胞，通過增加黏附因子和趨化因子表達促進炎癥反應(yīng)，并參與AS的發(fā)生發(fā)展過程。實驗研究發(fā)現(xiàn)，miR-155表達缺乏能夠降低巨噬細胞炎癥浸潤程度和抑制AS形成，而過表達miR-155則促進泡沫細胞的形成，促進炎癥反應(yīng)，加速AS形成。PDCD4是一種腫瘤抑制因子，PDCD4能夠激活NF-κB，抑制IL-10表達，促進炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖和凋亡。SOCS1是一種炎癥負向調(diào)控因子之一，能夠負向調(diào)控各種炎癥反應(yīng)，抑制TNF-α、IL-6、INF-γ等炎癥因子的產(chǎn)生，而miR-155能夠直接結(jié)合SOCS1，逆向調(diào)控巨噬細胞炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155通過調(diào)控SOCS1/p-STAT3炎癥信號通路調(diào)控PDCD4，影響TNF-α、IL-6、INF-γ的生成和AS發(fā)生。

高脂血癥可歸屬于中醫(yī)學(xué)“血濁”范疇，血濁可致痰、瘀、毒等病理產(chǎn)物產(chǎn)生，壅塞脈道，沉積管壁，形成AS。本課題組結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論及前期大量的臨床試驗，認為痰瘀證候是AS的主要證型，本研究所用血管軟化丸由保和丸化裁而成。方中山楂消食導(dǎo)滯，為君藥；黃芪補氣健脾，半夏健脾燥濕化痰，三七和丹參活血化瘀，共為臣藥；萊菔子下氣消食除脹，陳皮理氣和中，共為佐藥；甘草健脾和中，調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合用，共奏消積化痰、活血化瘀之功。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，血管軟化丸可通過調(diào)控miR-467b靶向LPL調(diào)控巨噬細胞，減少炎癥因子分泌和巨噬細胞脂質(zhì)蓄積，抑制AS發(fā)生發(fā)展。

本研究通過觀察血管軟化丸對miR-155和SOCS1/STAT3/PDCD4信號通路的調(diào)控，影響TNF-α、IL-6、IFN-γ的表達，從細胞、分子、組織水平多層次揭示血管軟化丸防治AS的作用靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，血管軟化丸能夠提高主動脈miR-155、SOCS1 mRNA表達水平，降低p-STAT3、PDCD4 mRNA表達水平，降低血清TNF-α、IL-6、IFN-γ水平，本實驗結(jié)果與血管軟化丸通過抑制炎癥反應(yīng)影響炎癥因子水平的既往結(jié)果一致。組織形態(tài)學(xué)觀察顯示，血管軟化丸組小鼠AS病變程度明顯輕于模型組，同時體外實驗也驗證了血管軟化丸含藥血清能夠提高ox-LDL損傷模型RAW264.7細胞中miR-155、SOCS1 mRNA表達水平，降低p-STAT3、PDCD4 mRNA表達水平。

本研究提示：miR-155能夠調(diào)控SOCS1-STAT3-PDCD4生物軸，影響TNF-α、IL-6、IFN-γ 3種炎癥因子表達；血管軟化丸抗AS的分子機制可能與調(diào)控miR-155和SOCS1/p-STAT3/PDCD4炎癥信號通路，影響TNF-α、IL-6、IFN-γ等炎癥因子水平有關(guān)。