多花黃精多糖PcUER1基因的克隆與表達(dá)分析

程 鶴，祝明珠，徐 君，劉峻麟，2，俞年軍，2，彭代銀，周 安，吳振東，韓榮春

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源保護(hù)與開發(fā)研究所，安徽 合肥 230012；3.安徽省青陽縣九華中藥材科技有限公司，安徽 池州 242800)

黃精為2020年版《中華人民共和國藥典》收載的常用中藥材，其正名始見于《名醫(yī)別錄》，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎等功效。其化學(xué)成分主要為多糖、甾體皂苷類，多花黃精多糖由多種單糖包括葡萄糖、甘露糖、巖藻糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖等構(gòu)成。黃精多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、降血糖、調(diào)血脂、提高免疫功能和記憶力等作用。

鼠李糖是一種單糖，其在植物體中主要的功能是參與植物多糖合成，也常作為細(xì)菌莢膜和細(xì)胞壁的組成成分，鼠李糖在植物和細(xì)菌界中的應(yīng)用很廣泛。3,5-異構(gòu)酶/4-還原酶(3,5-epimerase/4-reductase,UER1)是UDP-葡萄糖向UDP-鼠李糖轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶之一，這種酶有還原酶和異構(gòu)酶的酶活結(jié)構(gòu)域。龐朝友在棉花纖維素中發(fā)現(xiàn)該酶的基因，其為核苷糖并主要參與多糖的合成。擬藍(lán)芥細(xì)胞壁中存在該酶的基因，并參與鼠李糖的合成。UER1參與多糖的合成，并且是多糖合成中必不可少的酶基因。因此，本研究對(duì)多花黃精多糖中UER1基因進(jìn)行克隆，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為其多糖的生物合成提供理論參考，并為多花黃精中次生代謝產(chǎn)物的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；同時(shí)，構(gòu)建多花黃精PcUER1基因的質(zhì)粒的體外載體，為后續(xù)的蛋白組學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本課題組前期研究顯示，UER1是多花黃精多糖中第6種單糖UDP-鼠李糖的關(guān)鍵酶基因，而UDP-鼠李糖是由UDP-葡萄糖脫水酶(RHM)及UER1催化合成。

1 材料

1.1 藥材與試劑 多花黃精植株采自安徽省青陽縣等地，后移植至安徽中醫(yī)藥大學(xué)種質(zhì)資源圃，經(jīng)俞年軍教授鑒定為百合科黃精屬植物多花黃精

Polygonatum

cyrtonema

Hua。取多花黃精新鮮植株，分別為根、根莖、莖、葉4個(gè)部位，用清水洗凈表面泥土，先用75%乙醇無菌操作，并用無菌水洗凈3次，吸干水分，立即在液氮中研磨，置于-18 ℃冰箱保存，以備提取總RNA。

瓊脂糖凝膠DNA凝膠回收試劑盒(DP209-02)、pGM-TFast克隆試劑盒(VT151022)、FastQuant RT試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司。菌株與質(zhì)粒：DH5α。

1.2 儀器 PCR擴(kuò)增儀、Eppendorf 5810R型高速離心機(jī)：德國Eppendorf公司；ScanDrop200型核酸分析儀：德國Jena分析儀器股份有限公司；IMS-100全自動(dòng)雪花制冰機(jī)：江蘇省常熟雪科電器有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)：英國SYIGLHR/1528。

2 方法

2.1 總RNA提取及cDNA的合成 按照Liu等方法和Trizol試劑盒說明書提取RNA，先提取多花黃精4種部位的總RNA，再用ScanDrop檢測(cè)RNA的純度與濃度，使OD/OD和OD/OD均達(dá)到1.8以上，采用Aglient 2100檢測(cè)總RNA的完整性。采用FastQuant RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄RNA，得到第一鏈cDNA。

2.2 引物設(shè)計(jì)及PcUER1的序列信息確認(rèn) 對(duì)測(cè)序得到的PcUER1酶基因的序列信息進(jìn)行確認(rèn)。在NCBI中Blastx進(jìn)行檢索PcUER1序列，并保存同源物種中序列信息。使用在線程序Primer-BLAST設(shè)計(jì)多花黃精的特異性引物序列，進(jìn)行后續(xù)的PCR反應(yīng)。引物合成由上海生物工程股份有限公司提供。PcUER1基因克隆引物的正鏈為5′-CCGCGCAATTTCATCACCAA-3′，反鏈為5′-CCAGGGTTGGTGAAGTTCCA-3′；管家基因PcTubulin的正鏈為5′-TGGGATACGGCACGAGATTG-3′，反鏈為5′-CCGGAGATCCTTGGACATCG-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物為900 bp的DNA。

得到PcUER1第一鏈的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，通過1.0%瓊脂糖凝膠板對(duì)其進(jìn)行電泳檢測(cè)，在紫外燈條件下把凝膠板上明亮條帶產(chǎn)物切除，最后使用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒并按說明書操作方法回收并純化DNA。取純化cDNA，按照pGM-TFast克隆試劑盒操作步驟，讓其和載體pGM-TFast連接，得到連接載體產(chǎn)物，整個(gè)過程需在冰上進(jìn)行。將含有外源基因的質(zhì)粒通過熱休克轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α后，37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜。使用Invitrogen質(zhì)粒提取試劑盒回收質(zhì)粒后，使用ScanDrop檢測(cè)質(zhì)粒的濃度和純度，符合標(biāo)準(zhǔn)后，再使用T7-F/SP6通用引物PCR后，送至蘇州金唯智生物科技公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

2.3 生物信息學(xué)分析 使用NCBI中BLAST搜索比對(duì)PcUER1的同源序列，使用MEGAX軟件構(gòu)建該基因同源物種序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，使用軟件ProtParam、在線軟件SWISS-MODEL和在線軟件SOMPA對(duì)PcUER1基因編碼的蛋白序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析、二維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)多花黃精不同組織的PcUER1表達(dá)水平 將保留的合格RNA樣品(OD/OD>1.8,OD/OD>1.8)按照FastQuant試劑盒說明書操作步驟逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一條模板鏈。使用在線軟件Primer設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR所需的引物(見“2.2”項(xiàng))，使用穩(wěn)定性較好的微管蛋白基因(PcTubulin)作為內(nèi)參。選擇Fast Start Essential DNA Green Master作熒光染料，使用熒光定量PCR儀(ROCHE Z480型)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，每反應(yīng)體系為15 μL，各反應(yīng)均平行3次，以不含引物的反應(yīng)體系作陰性對(duì)照，并以溶解曲線分析以確保擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

2.5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 按照2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，取無水葡萄糖對(duì)照品33 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置10 mL具塞刻度試管中，用蒽酮-硫酸法測(cè)定含量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 多花黃精不同部位多糖含量檢測(cè) 分別將3株青陽多花黃精分為3組，每組不同部位干燥粉末取0.25 g，置圓底燒瓶中，加80%乙醇150 mL，置水浴中加熱回流1 h，趁熱濾過，將殘?jiān)鼮V紙置燒瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加熱回流1 h，趁熱濾過，合并濾液與洗液，放冷，轉(zhuǎn)移至250 mL量瓶中，定容精密量取1 mL，置10 mL具塞干燥試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下方法，自“加水至2.0 mL”起，測(cè)定吸光度，每組平行3次。

3 結(jié)果

3.1 多花黃精多糖PcUER1基因的克隆 基于多花黃精轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)。使用特異性引物PcUER1，20 μL體系擴(kuò)增，進(jìn)行cDNA的合成。電泳結(jié)果(見圖1)顯示，該基因在多花黃精莖中存在，并得到900 bp的單一明亮條帶，與預(yù)期的條帶大小一致。

注：M. DL2000；1、2均為PcUER1基因圖1 PcUER1基因的克隆

通過BioEdit軟件中GraphicsView功能將PcUER1基因的核酸序列轉(zhuǎn)譯成氨基酸序列。結(jié)果顯示PcUER1基因片段有900 bp，編碼299個(gè)氨基酸。PcUER1基因cDNA的核酸序列及推測(cè)的氨基酸序列見圖2。多花黃精與百合科虎眼萬年青和禾本科二棱大麥同源性較高，分別達(dá)92.03%、89.00%。

3.2 PcUER1蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用ProtParam軟件對(duì)PcUER1蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。通過分析蛋白分子式為CHNOS，其原子總數(shù)為4 714。由20種共299個(gè)氨基酸組成，分子量為33 510.25 Da，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)值為5.74，預(yù)測(cè)該蛋白較穩(wěn)定，其不穩(wěn)定系數(shù)為22.12，預(yù)估此蛋白在體外哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞中半衰期為30 h，酵母體內(nèi)達(dá)20 h以上，大腸桿菌體內(nèi)有10 h以上的半衰期。脂肪族指數(shù)為87.66，親水性總平均數(shù)為-0.257，提示該蛋白為疏水性蛋白。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，序列的N-末端是甲硫氨酸(Met)，氨基酸的個(gè)數(shù)及組成情況見表1。

注：紅色實(shí)心圓和綠色三角形表示輔因子結(jié)合基序和催化四分體基序圖2 PcUER1基因cDNA的核酸序列及氨基酸序列

表1 PcUER1氨基酸的組成

使用在線軟件SOMPA對(duì)PcUER1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果(見圖3)表明，此蛋白具有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲，分別占41.14%、6.35%、13.38%和39.13%。綜合分析結(jié)果顯示,PcUER1蛋白的主要結(jié)構(gòu)是α-螺旋，其次是無規(guī)則卷曲，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)最少。

以SWISS-MODEL在線軟件為平臺(tái)，得到的結(jié)果(見圖4)表明，該蛋白序列識(shí)別度為86.22%，與BLAST比對(duì)的覆蓋度可達(dá)95%，該蛋白與模板匹配的結(jié)果中有281個(gè)氨基酸配對(duì)成功，占總數(shù)的93.98%。

注：紫色示無規(guī)則卷曲，藍(lán)色示α-螺旋，綠色示β-轉(zhuǎn)角，紅色示延伸鏈；橫坐標(biāo)為堿基數(shù)圖3 PcUER1蛋白二維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖4 PcUER1蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

由圖4得出，與該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相一致的是，PcUER1編碼的蛋白預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)中有大量的無規(guī)則卷曲和α-螺旋，只有少量β-轉(zhuǎn)角，因此，可認(rèn)為該預(yù)測(cè)結(jié)果可信度高。

3.3 PcUER1系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建 將PcUER1基因序列的同源氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，多花黃精多糖中UER1酶基因同源序列眾多，比對(duì)結(jié)果中同源性相似度最高的為百合科虎眼萬年青(ANK57461.1)，在比對(duì)結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)百合科的其他種屬。以包含PcUER1編碼蛋白在內(nèi)的19種不同植物UER1氨基酸序列為模板，采用MEGAX軟件創(chuàng)建UER1系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖5)，以鄰位相連為統(tǒng)計(jì)方法，輔以配對(duì)刪除法對(duì)缺失數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。其中，多花黃精與百合科虎眼萬年青[

Albuca

bracteata

(

Thunb

.) J. C. Manning & Goldblatt]同源性最高，達(dá)到92.03%，由于虎眼萬年青和多花黃精同屬于百合科植物，故其同源性最高。由進(jìn)化樹結(jié)果可知，多花黃精與傘形科黃胡蘿卜、旋花科三裂葉薯等親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。

圖5 PcUER1的系統(tǒng)進(jìn)化樹

表2 多花黃精不同組織黃精多糖含量檢測(cè)結(jié)果

4 討論

黃精多糖是多花黃精的主要有效成分，已有研究表明，黃精多糖是由多種單糖構(gòu)成，包括鼠李糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和葡萄糖等，這些單糖在后續(xù)糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，形成其特征性多糖。在黃精多糖的合成途徑中需要UDP-鼠李糖，UDP-鼠李糖是組成多花黃精多糖的重要成分。UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)換成中間產(chǎn)物UDP-6-去氧-4-酮葡萄糖后，PcUER1在含有NADPH的環(huán)境下催化合成UDP-鼠李糖，且PcUER1參與纖維細(xì)胞次生壁的合成。PcUER1基因可能通過誘導(dǎo)某些特殊細(xì)胞壁多糖的合成和參與UDP-鼠李糖的合成，對(duì)黃精多糖的合成起到一定的作用。

UER1是多花黃精多糖中UDP-鼠李糖合成的關(guān)鍵酶基因，本研究以前期實(shí)驗(yàn)室測(cè)序獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)引物對(duì)PcUER1進(jìn)行克隆。經(jīng)凝膠回收、載體連接與轉(zhuǎn)化，在質(zhì)粒提取后進(jìn)行測(cè)序，確定了PcUER1序列，該基因序列長度為900 bp，編碼299個(gè)氨基酸，進(jìn)一步對(duì)PcUER1翻譯的蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)算，主要結(jié)構(gòu)是α-螺旋，其次是無規(guī)則卷曲，由20種共299個(gè)氨基酸組成，分子量為33 510.25 Da，預(yù)測(cè)該蛋白較穩(wěn)定，其理化性質(zhì)較為穩(wěn)定，在酵母等模式工程菌體內(nèi)可存在較長時(shí)間，適合進(jìn)行原核或真核異源表達(dá)。在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索PcUER1的同源基因，發(fā)現(xiàn)其與百合科虎眼萬年青的UER1相似性較高。通過對(duì)PcUER1基因及其蛋白的結(jié)構(gòu)與序列進(jìn)行分析，并檢索相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)PcUER1基因的活性位點(diǎn)有輔因子結(jié)合基序和催化四分體基序。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)PcUER1基因的表達(dá)信息進(jìn)行分析，結(jié)果在本次試驗(yàn)中實(shí)測(cè)情況與生物信息學(xué)數(shù)據(jù)吻合度較高，根莖中黃精多糖含量最高。Yin等研究表明，虎眼萬年青的多糖中鼠李糖的合成是由RHS1與UER1協(xié)同作用，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與黃精多糖含量檢測(cè)結(jié)果有細(xì)微差異的原因可能是RHS1與UER1或UER1與其他基因的協(xié)同作用。

本研究為PcUER1多糖合成途徑關(guān)鍵酶基因的克隆及其結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步研究提供了依據(jù)，也為將來多糖類生物合成途徑的解析及調(diào)控機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。