紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)快速鑒別不同環(huán)境發(fā)汗丹參

劉 潔，單曉曉，李國(guó)轉(zhuǎn)，彭代銀，王 雷，4，俞年軍，王國(guó)凱，陳衛(wèi)東，4

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院，安徽 合肥 230012；3.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012；4.中藥飲片制造新技術(shù)與研發(fā)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

丹參為唇形科植物丹參

Salvia

miltiorrhiza

Bge.的干燥根和根莖，主要活性成分包括脂溶性丹參酮類(lèi)及水溶性丹酚酸類(lèi)。丹參入藥，首見(jiàn)于東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》，屬于常用大宗中藥材。丹參在臨床上廣泛用于治療心腦血管系統(tǒng)疾病，還具有抗腫瘤、抗炎、保肝等作用。發(fā)汗是丹參的傳統(tǒng)產(chǎn)地初加工方法，通過(guò)發(fā)汗可以使丹參中化學(xué)成分發(fā)生變化。不同環(huán)境下發(fā)汗對(duì)丹參有效成分有影響，通常采用色譜、質(zhì)譜法進(jìn)行分析，但分析方法步驟復(fù)雜、檢測(cè)效率低，且僅反映相關(guān)分子的特性；而紅外光譜具有高度的專(zhuān)屬性和特征性，是鑒別物質(zhì)和分析物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的有效手段，可以反映藥材聚集態(tài)的宏觀特性，并在樣品峰和峰強(qiáng)度方面提供獨(dú)特的“指紋”，可以快速有效地對(duì)藥材質(zhì)量進(jìn)行整體控制。主成分分析(principal component analysis，PCA)為選用較少的幾個(gè)綜合指標(biāo)，能反映原來(lái)眾多具相關(guān)性的指標(biāo)信息，降低原始數(shù)據(jù)的維度，適用于中藥多種化學(xué)指標(biāo)的分析。PCA結(jié)合馬氏距離(Mahalanobis distance，MD)計(jì)算降維后的新變量，既保證光譜完整性，又不受變量間相關(guān)性和單位的影響。

本實(shí)驗(yàn)采取傅里葉紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立PCA-MD判別分析模型，擬比較不同環(huán)境下發(fā)汗丹參中醇提物和水提物，通過(guò)觀察比較各譜圖的吸收峰特征，為丹參發(fā)汗環(huán)境篩選提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Nicolet6700型傅里葉紅外光譜儀(氘代三甘氨酸硫酸酯檢測(cè)器)：美國(guó)Thermo公司；BJ-150型高速多功能粉碎機(jī)：德清拜杰電器有限公司；RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試劑 丹酚酸B(純度≥98%，DST190918-009)、丹參素(純度≥98%，DST191201-015)、丹參酮ⅡA(純度≥98%，DST190117-011)標(biāo)準(zhǔn)品：成都樂(lè)美天醫(yī)藥科技有限公司；溴化鉀碎晶：上海邁坤化工有限公司；乙醇(190401)：上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。丹參原藥材由安徽春之蔚農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，為種苗栽培的1年生丹參鮮品。原植物經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)彭華勝教授鑒定，丹參是唇形科鼠尾草屬

Salvia

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Bge.正品。

2 方法

2.1 供試品的制備

2.1.1 藥材的預(yù)處理 ①發(fā)汗丹參的制備：從鮮品丹參中挑選出粗細(xì)均勻的根條，去泥，去除蘆頭。將其隨機(jī)分成3組(每組約300 kg)，分別置于空曠陰涼、空曠光照、室內(nèi)環(huán)境下堆積，模擬丹參傳統(tǒng)產(chǎn)地加工“發(fā)汗”方法(即堆積7 d以使內(nèi)部水分溢出。在藥材堆中保留松散的間隙用于通風(fēng)，周邊略微覆蓋，并且定期打開(kāi)覆蓋物以進(jìn)行通風(fēng)。為了使整個(gè)藥材堆均勻排汗，將藥材堆展開(kāi)一夜，然后每2 d堆放1次，每次堆放2 d并攤開(kāi)一夜，重復(fù)以上操作3次。當(dāng)根的內(nèi)核變成紫紅色時(shí)，將藥材堆展開(kāi)并放在干凈、干燥、陰涼的地方晾干)發(fā)汗，編號(hào)分別為發(fā)汗1號(hào)堆、發(fā)汗2號(hào)堆和發(fā)汗3號(hào)堆，制成發(fā)汗丹參樣品。②非發(fā)汗丹參制備：將新鮮丹參根置于背陰、干燥、潔凈、通風(fēng)的地方晾干(過(guò)程中避免積壓，防止產(chǎn)熱)。

2.1.2 丹參水提物的制備 取丹參發(fā)汗及非發(fā)汗品適量，切成小段，加12倍量水浸泡1.5 h，于80 ℃提取2次，每次提取時(shí)間為1.5 h，合并提取液，濾過(guò)，濾液60 ℃減壓濃縮成清膏。放冷，加乙醇使含醇量為70%，靜置12 h，取上清液，減壓回收乙醇，并濃縮至稠膏，干燥，粉碎成細(xì)粉，過(guò)0.18 mm篩，即得丹參水提物。

2.1.3 丹參醇提物的制備 取丹參發(fā)汗及非發(fā)汗品適量，切成小段，加8倍量95%乙醇加熱回流提取3次，每次0.5 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓回收乙醇并濃縮成稠膏，用熱水洗至洗液無(wú)色，80 ℃下干燥，粉碎成細(xì)粉，過(guò)0.18 mm篩，即得丹參醇提物。

2.2 紅外光譜的測(cè)定 分別取發(fā)汗、非發(fā)汗水提及醇提粉末與溴化鉀以1∶50比例混合，置瑪瑙研缽中研磨成極細(xì)粉，轉(zhuǎn)移至紅外光譜測(cè)定專(zhuān)用模具中，用10 t以下的壓力壓成均勻透明的薄片；光譜范圍為4 000～525 cm，每張光譜累加掃描16次，光譜分辨率為4 cm，掃描過(guò)程中實(shí)時(shí)排除二氧化碳和水蒸氣干擾。

2.3 光譜數(shù)據(jù)處理 利用傅里葉變換紅外光譜儀得到相應(yīng)的紅外光譜圖；用OMNIC 9.0軟件進(jìn)行自動(dòng)基線(xiàn)校正和縱坐標(biāo)歸一化處理，采用Origin 8.0軟件繪制紅外光譜圖，用The Unscrambler 11軟件對(duì)光譜圖進(jìn)行優(yōu)化處理后建立PCA-MD判別模型。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)

3.1.1 精密度考察 將丹參醇提物與溴化鉀按比例混合后壓片，重復(fù)測(cè)定其紅外圖譜6次，6張紅外圖譜共有峰波數(shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)小于4.08%。

3.1.2 穩(wěn)定性考察 分別在0、1、2、4、8、24 h對(duì)同一壓片紅外光譜進(jìn)行測(cè)定，6張紅外圖譜共有峰波數(shù)的RSD小于8.08%。

3.1.3 重復(fù)性考察 將丹參醇提物制成6個(gè)壓片測(cè)定紅外圖譜，6張紅外圖譜共有峰波數(shù)的RSD小于4.84%。

3.3 不同環(huán)境下發(fā)汗丹參水提物的紅外光譜圖分析 從圖3中可知：①3種不同環(huán)境下發(fā)汗丹參的平均紅外光譜圖的峰形基本相似；②不同環(huán)境發(fā)汗丹參水提物平均光譜峰強(qiáng)度在A區(qū)域(3 700～2 800 cm)和B區(qū)域(1 800～500 cm)存在明顯差異，發(fā)汗后1 520、1 262 cm處吸收峰較非發(fā)汗品增強(qiáng)，推測(cè)酚酸類(lèi)含量增加，且在發(fā)汗過(guò)程中1 041 cm處吸收峰強(qiáng)度降低，可能為多糖類(lèi)成分降解，發(fā)汗3號(hào)堆(室內(nèi)環(huán)境)強(qiáng)度明顯高于其他發(fā)汗品，2號(hào)堆次之；③在B區(qū)域(指紋區(qū))，少數(shù)吸收峰在位置和強(qiáng)度上有差異。

為了更直觀地比較不同環(huán)境發(fā)汗丹參紅外光圖譜的差異，對(duì)1 800～800 cm區(qū)域進(jìn)行二階求導(dǎo)處理(見(jiàn)圖4)。對(duì)一系列動(dòng)態(tài)紅外光譜進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，不僅提高紅外光譜圖的分辨率，而且提供基團(tuán)之間相關(guān)性的詳細(xì)結(jié)構(gòu)信息，可用于鑒別和研究物質(zhì)成分或基團(tuán)之間的相互作用，增強(qiáng)圖譜特征。如非發(fā)汗丹參在1 520.85、1 404.02 cm處和發(fā)汗品在1 521.53、1 405.86 cm的吸收峰對(duì)應(yīng)甲基和亞甲基彎曲振動(dòng)。但發(fā)汗丹參吸收峰強(qiáng)度略高于非發(fā)汗品，提示酚酸類(lèi)含量增加；非發(fā)汗的1 261.59 cm處、發(fā)汗的1 260.92 cm峰對(duì)應(yīng)丹參素鈉在1 261 cm處的吸收峰，發(fā)汗吸收峰強(qiáng)度高于非發(fā)汗品，表明發(fā)汗后含酚酸類(lèi)含量增加。同樣，在1 200～600 cm范圍內(nèi)為糖類(lèi)異構(gòu)體特征吸收區(qū)，可以明顯觀察到發(fā)汗丹參碳水化合物的相對(duì)含量較非發(fā)汗丹參略有下降，提示在發(fā)汗過(guò)程中多糖類(lèi)成分降解。

圖1 丹參酮ⅡA(A)、丹參醇提物(B)、丹參素(C)、丹酚酸B(D)及丹參水提物(E)的一維紅外光譜圖

圖2 丹參酮ⅡA(A)、丹參醇提物(B)、丹參素(C)、丹酚酸B(D)、丹參水提物(E)的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖

3.5 丹參發(fā)汗與非發(fā)汗水提物、醇提物的紅外光譜分析 圖3中，發(fā)汗與非發(fā)汗丹參水提物與醇提物一維紅外光譜相似，但在吸收強(qiáng)度和吸收帶上有一定差異。如水提物特征吸收帶是1 520 cm處，而醇提物在此無(wú)吸收；醇提物特征吸收帶在1 670 cm處的吸收峰強(qiáng)于水提物，而水提物在此無(wú)吸收，由此可區(qū)分水提物和醇提物。不同環(huán)境發(fā)汗丹參絕大部分特征吸收峰一一對(duì)應(yīng)，但部分特征吸收峰存在數(shù)目、位置和吸收強(qiáng)度的差異，表明丹參經(jīng)不同環(huán)境下發(fā)汗后化學(xué)成分和含量發(fā)生了改變。

注：A.非發(fā)汗水提物；B.發(fā)汗1號(hào)堆水提物；C.發(fā)汗2號(hào)堆水提物；D.發(fā)汗3號(hào)堆水提物；E.非發(fā)汗醇提物；F.發(fā)汗1號(hào)堆醇提物；G.發(fā)汗2號(hào)堆醇提物；H.發(fā)汗3號(hào)堆醇提物圖3 非發(fā)汗與不同環(huán)境下發(fā)汗丹參水提物與醇提物的一維紅外光譜圖

3.6 PCA-MD判別分析模型

3.6.1 光譜圖優(yōu)化處理 對(duì)8組樣品(每組3批)的紅外光譜圖進(jìn)行一階求導(dǎo)、二階求導(dǎo)、一階求導(dǎo)加平滑、二階求導(dǎo)加平滑處理后，發(fā)現(xiàn)最佳預(yù)處理方案為二階求導(dǎo)加平滑，提取前5個(gè)主成分時(shí)變量特征的解釋能力達(dá)到81.2%，且判別正確率為100%，故選此方法建立PCA-MD判別模型。見(jiàn)表1。

3.6.2 建立判別模型 不同環(huán)境下發(fā)汗丹參經(jīng)預(yù)處理后，提取前5個(gè)主成分進(jìn)行PCA-MD判別分析(見(jiàn)圖5)，8組樣品可以分開(kāi)。發(fā)汗與非發(fā)汗丹參的醇提物距離較近，推測(cè)其經(jīng)過(guò)發(fā)汗處理后化學(xué)成分變化相似，丹參經(jīng)發(fā)汗后化學(xué)成分發(fā)生不同程度的改變，根據(jù)其差異可將丹參不同發(fā)汗品完全區(qū)分，且差異越大，空間距離越大。

4 討論

紅外光譜由分子的振動(dòng)及轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的躍遷引起，主要用于定性鑒別和結(jié)構(gòu)分析，且樣品不需要進(jìn)行前處理，使樣品之間的微小差異能夠最大限度地保留下來(lái)，不會(huì)被人為干擾、甚至破壞，因此，可以從整體上表征不同環(huán)境下發(fā)汗丹參的差異。不同環(huán)境下發(fā)汗丹參的原始圖譜峰形變化極為相似，且共有峰較多，可顯示出丹參特有的光譜特征，這與課題組前期用高效液相色譜指紋圖譜鑒別結(jié)果一致，說(shuō)明發(fā)汗處理后的丹參整體化學(xué)組分并沒(méi)有發(fā)生改變。經(jīng)二階求導(dǎo)及結(jié)合化學(xué)計(jì)量法，表明丹參經(jīng)不同環(huán)境下發(fā)汗后化學(xué)成分和含量發(fā)生了改變。發(fā)汗后水提物中酚酸類(lèi)含量增加，與鄧寒霜等研究的發(fā)汗后酚酸類(lèi)含量均有增加相一致，且發(fā)汗3號(hào)堆(室內(nèi)環(huán)境)強(qiáng)度明顯高于其他發(fā)汗品，2號(hào)堆次之；醇提物酮類(lèi)含量升高，與課題組前期研究及趙志剛等的研究結(jié)果相符，且發(fā)汗2號(hào)堆(空曠光照)強(qiáng)度明顯高于其他炮制品，3號(hào)堆次之，與課題組前期研究結(jié)果一致；在發(fā)汗過(guò)程中可能發(fā)生糖苷的水解和糖類(lèi)的代謝。紅外光譜結(jié)合PCA-MD判別模型可準(zhǔn)確區(qū)分發(fā)汗與非發(fā)汗丹參，丹參發(fā)汗后含量的變化可能與堆置發(fā)汗過(guò)程中生物組織內(nèi)部的微生物和功能酶系促發(fā)資源性化學(xué)物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化與化學(xué)轉(zhuǎn)化有關(guān)，具體發(fā)汗機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

注：A.非發(fā)汗水提物；B.發(fā)汗1號(hào)堆水提物；C.發(fā)汗2號(hào)堆水提物；D.發(fā)汗3號(hào)堆水提物；E.非發(fā)汗醇提物；F.發(fā)汗1號(hào)堆醇提物；G.發(fā)汗2號(hào)堆醇提物；H.發(fā)汗3號(hào)堆醇提物圖4 非發(fā)汗與不同環(huán)境下發(fā)汗水提物與醇提物二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖

表1 光譜預(yù)處理對(duì)PCA-MD判別模型的影響

圖5 PCA-MD得分圖