基于SIRT1/PGC-1α通路探討電針聯(lián)合豐富康復訓練對腦缺血大鼠氧化應激的影響

姚曉雯，唐 巍，李夢醒，蘭 崴，王 玉，高云云，金子開

(安徽中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，安徽 合肥 230012)

缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)的生理病理過程屬于多因素參與、多環(huán)節(jié)循環(huán)、多途徑損傷的酶促級聯(lián)反應。因其高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率，CIS嚴重威脅人類健康。既往研究顯示，電針與現代康復醫(yī)學聯(lián)合的治療模式通過抗炎、增強神經可塑性、促血管新生、抑制細胞凋亡等多種途徑改善腦部供血，促進神經損傷修復。沉默信息調節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)/過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)是一條內源性的抗氧化損傷通路，SIRT1通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)依賴的去乙?；{控PGC-1α活性，參與氧化應激、能量代謝、細胞凋亡等多種生物學途徑。本實驗通過觀察電針聯(lián)合豐富康復訓練對大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠SIRT1/PGC-1α通路及相關凋亡基因[B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶-9(cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase-9)]的影響，從氧化應激角度闡明電針聯(lián)合豐富康復訓練的神經保護機制。

1 材料

1.1 實驗動物 選取清潔級成年健康雄性SD大鼠75只，體質量為(300±20)g，于(23±3)℃、45%～55%濕度環(huán)境下自由飲食飼養(yǎng)，術前禁食不禁水。本實驗經安徽中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準，實驗動物生產許可證號為SCXK(魯)2019-0003。

1.2 試劑與儀器 熒光顯微鏡(BA410E)：Motic公司；石蠟切片機(TM2135)：Leica公司；激光多普勒儀(FP 50 Shift)：北廷測量技術公司；熒光定量PCR儀(PIKOREAL 96)：Thermo Scientific；丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)(A003-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(A001-1)：南京建成生物工程研究院；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(C1088)：Beyotime公司；SIRT1(bs-0921R)：Bioss；PGC-1α(SC-517380)：Santa Cruz；Bcl-2(RS-0032R)、Caspase-3(ab32351)和Caspase-9抗體(ab32539)：上海瑞齊生物科技公司。

1.3 康復訓練器材 FT-200動物跑步機：成都泰盟軟件公司；Roto-Rod Series 8轉棒測試儀：上海達燊實業(yè)有限公司；網屏(50 cm×40 cm)、平衡木(170 cm×2 cm)、自制豐富環(huán)境籠(籠中放置彩球、塑料管隧道、積木等)。

2 方法

2.1 動物模型復制方法及分組 隨機選取15只大鼠為假手術組，僅分離頸動脈，不進行結扎和插線步驟。其余大鼠參照Longa線栓法復制MCAO模型。按40 mg/kg劑量腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，麻醉后將大鼠仰臥位固定于鼠板，在右側頸部做一切口，鈍性分離皮下組織，充分暴露右側頸總動脈并用縫合線標記，繼續(xù)分離頸外及頸內動脈，縫合線結扎頸外動脈遠心端并電凝，用動脈夾暫時夾閉頸總及頸內動脈，在頸外動脈殘端作一“V”型切口，將尼龍線插入，待線栓前端抵達分叉處時放開頸內動脈處動脈夾，繼續(xù)向頸內動脈深入，深度為18～20 mm，以微遇阻力為度。麻醉清醒后4 h，參考改良神經功能缺損評分(modified neurological severity scores，mNSS)量表評估大鼠神經功能狀態(tài)，2～18分為模型復制成功。將模型復制成功的大鼠按隨機數字表法分為模型組、電針組、康復組和聯(lián)合組，每組15只。

2.2 治療方法 電針組和聯(lián)合組電針選穴參照《實驗針灸學》及《大鼠穴位圖譜的研制》，選取“百會”“大椎”進行針刺。模型復制后4 h開始治療，用固定器限制大鼠行動，暴露針刺穴位，以疏密波，頻率5～30 Hz，電流1～2 mA進行電針治療。康復組和聯(lián)合組進行豐富環(huán)境與康復訓練。豐富環(huán)境治療：將大鼠置于自制豐富環(huán)境籠中，給予聲音、顏色和燈光刺激?？祻陀柧氈委煟簩⒋笫笾糜诓煌鞑纳希謩e進行跑臺、轉棒、網屏、平衡木訓練，以上治療均每次30 min，每日1次，共治療3 d。

2.3 激光多普勒測定缺血側皮質區(qū)腦血流量 在插線后5 min及最末次治療結束后進行大鼠缺血區(qū)局部腦血流量測定。麻醉大鼠后將其頭部固定于腦立體定位儀上，沿正中線偏左側剃毛，暴露顱骨，根據《大鼠腦立體定位圖譜》用牙科鉆沿冠狀縫與矢狀縫定位并鉆開一顱窗(約4 mm×3 mm)，將多普勒光纖探頭固定至顱窗處，測量并記錄。

2.4 生化檢測缺血側皮質區(qū)SOD、MDA水平 取大鼠腦組織皮質區(qū)制備組織勻漿，根據SOD、MDA試劑盒說明書依次進行操作，用酶標儀測定各管吸光度值，根據公式計算SOD活力值與MDA的含量。

2.5 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色和TUNEL法觀察大鼠缺血側皮質區(qū)形態(tài)學變化與陽性細胞率 將大鼠處死，取出全腦，用4%多聚甲醛固定，進行石蠟包埋，制成石蠟切片。一部分用HE染液進行染色，另一部分滴加蛋白酶K(不含DNase)，37 ℃作用20 min以消化蛋白質，PBS洗滌3次，將蛋白酶K沖洗干凈。配制并加入50 μL TUNEL反應液，避光孵育60 min，PBS反復沖洗，DAPI染細胞核，封片，熒光顯微鏡下觀察大鼠缺血側皮質區(qū)，隨機選取400倍視野進行陽性細胞計數，并計算陽性細胞率(陽性神經細胞數/神經細胞總數)。

2.6 RT-PCR法檢測大鼠缺血側皮質區(qū)SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達水平 Trizol試劑提取各組大鼠皮質區(qū)總RNA，使用微量核酸蛋白分析儀測定260、280 nm的OD值。而后參照逆轉錄試劑盒，進行PCR擴增。PCR反應條件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。引物序列如表1所示，采用2-ΔΔC法計算SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 mRNA的相對表達水平。

表1 各檢測指標的引物序列

3 結果

3.1 各組大鼠缺血側皮質區(qū)腦血流量比較 與假手術組相比，模型組插線后5 min、3 d的腦血流量均明顯下降(

P

<0.05)。與模型組相比，各治療組插線后5 min腦血流量差異無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)，治療3 d后聯(lián)合組腦血流量顯著增高(

P

<0.05)；與電針組、康復組相比，聯(lián)合組腦血流量顯著升高(

P

<0.05)。見表2。3.2 各組大鼠缺血側皮質區(qū)MDA、SOD水平比較 與假手術組相比，模型組MDA水平上升，SOD水平下降(

P

<0.05)；與模型組相比，各治療組MDA水平均下降，SOD水平均升高(

P

<0.05)；與電針組和康復組相比，聯(lián)合組MDA水平降低，SOD水平升高(

P

<0.05)。見表3。兩因素方差分析顯示，治療手段對氧化應激因子表達水平的主效應具有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)；電針聯(lián)合豐富康復訓練對MDA、SOD表達水平存在交互效應(

P

<0.05)。見表4。

表2 各組大鼠缺血側皮質區(qū)腦血流量比較

表3 各組大鼠缺血側皮質區(qū)MDA、SOD水平比較

表4 電針與康復訓練對腦缺血大鼠氧化應激因子表達水平影響的兩因素析因設計方差分析結果

3.3 各組大鼠缺血側皮質區(qū)形態(tài)學變化及陽性細胞率比較 HE染色結果顯示，假手術組皮質區(qū)神經細胞排列整齊，結構完整，核仁清晰；模型組神經細胞排列紊亂，細胞結構出現不同程度破壞，如核固縮、嗜染質。與模型組相比，各治療組均出現好轉趨勢，雖有不同程度的間質水腫、排列紊亂，但可以看到皮質區(qū)嗜染質相對較少，細胞結構破壞程度相對減輕，聯(lián)合組尤為明顯。見圖1。TUNEL染色結果顯示，假手術組僅有少量陽性細胞。與假手術組相比，模型組大鼠缺血側皮質區(qū)陽性細胞數大量增加，陽性細胞率大幅升高(

P

<0.05)；與模型組相比，各治療組陽性細胞數減少，陽性細胞率均呈下降趨勢(

P

<0.05)；與電針組、康復組相比，聯(lián)合組陽性細胞數量相對變少，陽性細胞率降低(

P

<0.05)。見圖2和表5。3.4 各組大鼠缺血側皮質區(qū)SIRT1、PGC-1α、BCL-2、Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達水平比較 與假手術組相比，模型組SIRT1、PGC-1α、Bcl-2 mRNA表達水平均顯著減少(

P

<0.05)，Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達水平顯著增加(

P

<0.05)。與模型組相比，各治療組SIRT1、PGC-1α、Bcl-2 mRNA表達水平均顯著增加(

P

<0.05)，Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達水平顯著減少(

P

<0.05)。見表6。兩因素方差分析結果顯示，分組因素對SIRT1、PGC-1α mRNA表達水平的主效應有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)；電針與豐富康復訓練聯(lián)合干預對SIRT1、PGC-1α mRNA的表達水平存在交互作用(

P

<0.05)，對凋亡相關基因表達水平的影響無交互作用(

P

>0.05)。見表7、表8。

圖1 各組大鼠缺血側皮質區(qū)形態(tài)學變化(HE染色，10×40倍)

4 討論

CIS屬中醫(yī)“中風”范疇，基本病機為氣血逆亂，上犯于腦，腦之神明失用，證候多為本虛標實。研究顯示，電針通過穴位感受器、神經遞質將腧穴局部效應傳入中樞，在腦損傷疾病中有顯著療效。豐富康復訓練具有獨特優(yōu)勢，可刺激腦部特定運動區(qū)域，改善腦組織微循環(huán)，實現神經細胞再生與功能重組。在腦缺血中，氧化應激是破壞神經細胞活力和組織損傷的主要條件，自由基的大量釋放會影響DNA、脂質和蛋白質等重要生物分子，造成細胞損傷。

SIRT1是依賴于NAD的去乙酰化酶，在應激反應中起關鍵作用，PGC-1α作為其下游靶點，正常情況下可與SIRT1形成轉錄復合體控制代謝基因表達。腦缺血時，神經細胞處于氧化應激狀態(tài)，治療手段干預激活SIRT1/PGC-1α通路，提升抗氧化酶和抗氧化劑能力，減少氧化應激和神經細胞凋亡。

圖2 各組大鼠缺血側皮質區(qū)細胞凋亡情況(TUNEL熒光染色，10×40倍，白色箭頭表示凋亡細胞)

表5 各組大鼠缺血側皮質區(qū)陽性細胞率比較

兩因素方差分析顯示，治療手段對MDA、SOD、SIRT1、PGC-1α、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2 mRNA表達水平的主效應均有統(tǒng)計學意義，說明本實驗治療手段是影響結果的主要因素。研究發(fā)現，氧化應激因子、SIRT1、PGC-1α和凋亡細胞因子的表達具有一定規(guī)律性。腦缺血后，MDA含量增加，SOD活性下降，提示腦內自由基過表達，抗氧化物被消耗，腦內氧化失衡。此時，缺血側皮質區(qū)SIRT1 mRNA表達減少，下游PGC-1α mRNA表達水平也隨之下降，缺血側凋亡細胞大幅增多，Caspase-3、Caspase-9表達增多，Bcl-2表達減少，提示缺血性腦損傷后氧化應激持續(xù)發(fā)生，細胞凋亡途徑啟動。3種治療手段均能使SIRT1、PGC-1α mRNA表達水平上調，Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達水平下調，Bcl-2 mRNA表達水平上調，提示不同治療手段通過上調SIRT1/PGC-1α通路，發(fā)揮抗缺血性腦損傷作用。聯(lián)合組通過電針與康復的交互效應，顯著上調SIRT1、PGC-1α mRNA的表達，提示外周康復刺激與直接電針刺激共同生成的效應產物能減輕缺血后腦組織氧化應激損傷，發(fā)揮神經保護作用。但聯(lián)合組對凋亡因子表達水平的交互作用無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)，提示腦缺血急性期，電針聯(lián)合豐富康復訓練對細胞凋亡有抑制作用，但交互作用并不明顯。

表6 各組大鼠缺血側皮質區(qū)SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達水平比較

表7 電針與康復訓練對腦缺血大鼠SIRT1、PGC-1α mRNA表達水平影響的兩因素析因設計方差分析結果

表8 電針與康復訓練對腦缺血大鼠凋亡相關基因表達水平影響的兩因素析因設計方差分析結果

目前，SIRT1/PGC-1α通路在CIS的基礎性研究成果甚少，電針與康復療法聯(lián)合調控缺血后氧化應激機制研究尚不多見。本實驗通過電針聯(lián)合豐富康復訓練對MCAO大鼠進行干預，發(fā)現電針法、康復法、聯(lián)合法均在不同程度上激活了SIRT1/PGC-1α通路，調節(jié)氧化應激，抑制細胞凋亡；且電針與康復聯(lián)合治療對SIRT1、PGC-1α mRNA表達水平的影響具有交互效應(

P

<0.05)，發(fā)揮正向協(xié)同作用。本研究中選擇3 d作為治療終點，旨在觀察SIRT1/PGC-1α通路在急性期的抗氧化和神經保護作用，但本實驗僅評估SIRT1/PGC-1α通路的即時效應，在后續(xù)研究中，應延長治療觀察期，對電針聯(lián)合豐富康復訓練與氧化應激相關性進行深入研究。