黃曲霉毒素B1熒光定量快速檢測試紙卡和儀器技術性能優化研究*

鞏性濤 王 培 肖理文 宋永泉 徐 秀 趙 皖

(1 山東省糧油檢測中心 250101)(2 南京微測生物科技有限公司 210000)

黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1簡寫為AFB1)是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，含有一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮(香豆素)，具有強致癌性以及劇毒性，是迄今發現的各種真菌毒素中最穩定的一種。從1993年開始黃曲霉毒素被認定為世界衛生組織(WHO)癌癥研究機構劃定的一類致癌物，是世界公認的三大強致癌物質之一，而黃曲霉毒素B1由于毒性最大，污染最重，是危害最大的一種黃曲霉毒素[1]。

黃曲霉毒素B1污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麥、花生油等糧油食品，且以南方高溫、高濕地區受污染最為嚴重，北方黃淮地區特別是玉米、小麥、花生污染程度上升尤為明顯[2]。《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》(GB 2761-2011)中對糧食谷物及其制品中黃曲霉毒素B1的最高限量為20 μg/kg，《飼料衛生標準》(GB 13078-2001)中對不同種類的飼料中黃曲霉毒素B1的最高限量標準從10 μg/kg～50 μg/kg不等。

目前，國標法測定黃曲霉毒素B1采用HPLC法，需要大型的儀器設備，價格昂貴，操作過程復雜、時間較長，且無法在現場和基層小型實驗室使用。除此之外，也有采用黃曲霉毒素B1酶聯免疫試劑盒或膠體金快速檢測試紙卡用于大量樣品的篩查，操作簡便，檢測快速，成本也較低，但準確性和重復性較差，容易造成假陽性或者假陰性，國外同類進口設備和試劑條準確性和重復性雖然有所提高，但成本高，糧油收儲、糧食加工和飼料企業難以接受。為此，山東糧油檢測中心與南京微測生物科技有限公司對基于熒光定量免疫層析平臺的黃曲霉毒素B1熒光定量快速檢測試紙卡進行了產品的進一步優化升級，使之操作簡單、準確性和重復性較高，且使用成本較進口降低30%，能更好滿足不同客戶的日常檢測需求，確保糧食和食品安全。

1 材料和方法

1.1 試劑和材料

除注明外，均為分析純，試驗用水均為國標一級標準蒸餾水。

黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙卡由乳膠墊、NC膜、樣品墊及吸收墊組成，乳膠墊上包裹有熒光微球標記黃曲霉毒素B1抗體；NC膜上噴涂有黃曲霉毒素B1抗原的檢測線和噴涂有羊抗兔二抗的控制線。樣品提取液、樣品稀釋液、標準曲線ID卡及標準曲線條形碼均為上海生產。黃曲霉毒素B1的標準品：購自Sigma公司；大米、玉米、小麥、面粉等樣品從超市購得或從企業獲得。麩皮，小麥、面粉等飼料樣品從糧食加工和收儲企業獲得。

1.2 儀器與設備

FD-600型熒光免疫定量分析儀和FD-2000型試紙卡恒溫孵育器：上海生產；低速離心機：上海生產；漩渦混勻器：海門生產；電子天平：Sartorius。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的前處理 取具有代表性的待測樣品500 g，用粉碎機粉碎1 min后過20目篩，收集過篩后的均勻細小樣品。稱取過篩后的樣品5.0 g±0.02 g于50 mL離心管中，加入25 mL提取液，用漩渦混勻器振蕩5 min(或者搖床振蕩5 min)后，4000RPM離心2 min。

1.3.2 檢測過程 取100 μL離心上清液加入500 μL 樣品稀釋液中，用漩渦混勻器混勻3 s～5 s，然后取100 μL加入到黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙卡的加樣孔中，置于37℃恒溫孵育器中溫育8 min，8 min后將試紙卡插入熒光免疫定量分析儀中讀數，讀數值即為樣品的實際檢測濃度。當檢測值大于75 μg/kg時，可將離心上清液稀釋5倍后再進行檢測，所得讀數值乘以對應的稀釋倍數即為最終的檢驗結果。

1.3.3 試紙卡原理 當將待測樣品滴加在試紙卡加樣區時，樣品中的黃曲霉毒素B1與結合墊中熒光微球標記的黃曲霉毒素B1抗體結合并通過毛細作用向前層析，到達檢測區后，檢測線T線上固定的黃曲霉毒素B1抗原與剩余未結合的熒光微球標記黃曲霉毒素B1抗體結合。檢測線T線上結合的熒光微球標記抗體的量與樣品中待測物的量成反比，質控線C線結合的熒光標記物與樣品中待測物的量無關，剩余或其它熒光標記物繼續層析達到吸收區。反應結束后，使用熒光定量快速檢測儀讀取T線和C線的熒光強度并計算T/C值，通過儀器內置的標準曲線即可計算出樣品中黃曲霉毒素B1的含量。

1.3.4 試紙卡優化 在單T線的基礎上，增加1條矯正T線，形成質控線C線1條、檢測線T線2條的方式。

2 結果分析

2.1 黃曲霉毒素B1試紙卡檢測線數量由兩線優化成三線的實驗結果

選用國標法測定黃曲霉毒素B1濃度值為空白的樣本中分別添加黃曲霉毒素B1的濃度為2.5 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、25 μg/kg、50 μg/kg，然后按照黃曲霉毒素B1試紙卡檢測方法同時進行兩線及三線試紙卡檢測，每個加標樣本各檢測2個平行樣，對比試紙卡靈敏度，檢測結果見表1；選取高、中、低3個加標濃度點，每個加標樣本檢測6個平行樣，檢測對比試紙卡的重復性，檢測結果見表2。

表1 黃曲霉毒素B1兩線與三線試紙卡的靈敏度 (單位：μg/kg)

表2 黃曲霉毒素B1兩線與三線試紙卡的重復性 (濃度單位：μg/kg)

從表1可知，黃曲霉毒素B1三線試紙卡的2.5 μg/kg檢測靈敏度為22.03%；兩線試紙卡的2.5 μg/kg檢測靈敏度為16.39%；從單一2.5 μg/kg濃度點檢測靈敏度對比，三線試紙卡靈敏度更高；且綜合對比不同濃度的檢測靈敏度，也得出黃曲霉毒素B1三線試紙卡靈敏度較兩線試紙卡更高。從樣本加標檢測靈敏度對比，可選黃曲霉毒素B1三線試紙卡。

從表2可知，篩選高、中、低三個濃度點進行重復性檢測，黃曲霉毒素B1三線試紙卡檢測變異系數CV范圍為4.26%～8.11%；兩線試紙卡檢測變異系數CV范圍為7.50%～11.25%；對比三線試紙卡與兩線試紙卡的檢測變異系數CV范圍，三線試紙卡檢測變異系數CV范圍更小，重復性更高；從樣本加標檢測重復性對比，可選黃曲霉毒素B1三線試紙卡。

綜合黃曲霉毒素B1三線試紙卡與兩線試紙卡的靈敏度與重復性對比，選擇黃曲霉毒素B1三線試紙卡。

2.2 選用檢測線數量為三線的黃曲霉毒素B1試紙卡進行產品性能檢測

2.2.1 黃曲霉毒素B1試紙卡檢出限及定量限實驗結果 選用國標法測定黃曲霉毒素B1濃度值為空白的樣本20份，然后按照黃曲霉毒素B1試紙卡檢測方法進行檢測，每個樣本檢測1個試紙卡。檢測結果見表3。

由表3中檢測數據分析可知：黃曲霉毒素B1試紙卡的檢出限為0.4 μg/kg；定量限為0.983 μg/kg。

2.2.2 黃曲霉毒素B1試紙卡的檢測范圍的實驗結果 選用國標法測定黃曲霉毒素B1濃度值為空白的樣本中分別添加黃曲霉毒素B1的濃度為1 μg/kg、2.5 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、25 μg/kg、50 μg/kg、75 μg/kg，然后按照黃曲霉毒素B1試紙卡檢測方法進行檢測，每個加標樣本各檢測2個平行樣。檢測結果見表4。

通過表4的檢測數據可知，在空白樣本中添加黃曲霉毒素B1的濃度為1 μg/kg時，檢測靈敏度為10.41%，與空白樣本檢測存在梯度差；陰性樣本加標濃度從1 μg/kg～75 μg/kg時，檢測靈敏度范圍為10.41%～95.07%，且不同濃度點檢測抑制率分散率較好，故黃曲霉毒素B1可定量檢測范圍為1 μg/kg～75 μg/kg。

表4 黃曲霉毒素B1試紙卡的檢測范圍 (單位：μg/kg)

2.2.3 黃曲霉毒素B1試紙卡的準確度和重復性實驗結果 選用國標法測定黃曲霉毒素B1濃度值為空白的樣本中分別添加黃曲霉毒素B1濃度為1 μg/kg、2.5 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、25 μg/kg、50 μg/kg、75 μg/kg，然后按照黃曲霉毒素B1熒光定量試紙卡的檢測方法進行檢測，每個加標樣本各檢測3個平行樣。檢測結果見表5。

通過表5可知，大米樣本的加標回收率為88.34%～103.17%；玉米樣本的加標回收率為85.72%～109.09%；小麥樣本的加標回收率為95.40%～117.53%；綜合三種不同基質樣本加標檢測回收率范圍為85.72%～117.53%，說明樣本加標檢測回收率高，黃曲霉毒素B1試紙卡檢測準確度較高。

表5 黃曲霉毒素B1試紙卡的準確度和重復性 (單位：μg/kg)

大米樣本的變異系數CV范圍為0.64%～10.81%；玉米樣本的重變異系數CV范圍為3.29%～11.25%，小麥樣本的變異系數CV范圍為2.19%～11.58%；綜合三種不同基質樣本加標檢測變異系數CV范圍為0.64%～11.58%，說明黃曲霉毒素B1試紙卡整體變異系數CV較小，試紙卡重復性較好。

2.2.4 黃曲霉毒素B1試紙卡穩定性的實驗結果 黃曲霉毒素B1檢測在2℃～10℃環境下，并在每個月固定日期進行樣本檢測，篩選固定不同基質已知不同濃度值樣本(拜發質控物)用于試紙卡穩定性檢測，每個樣本檢測1個試紙卡，檢測結果見表6。

表6 黃曲霉毒素B1試紙卡的穩定性

通過表6數據可知，黃曲霉毒素B1試紙卡在2℃～10℃保存8個月，不同基質樣本的檢測偏差范圍為4.92%～10.82%，說明黃曲霉毒素B1試紙卡在正常溫度8個月的保存整體偏差在10%以內，說明產品穩定性較好。

2.3 利用黃曲霉毒素B1試紙卡測定儀器的穩定性與臺間差

2.3.1 采用一臺儀器設備，每小時測定固定值樣本濃度，連續測定12次，以該方法12 h測定數據的標準差和極差是否超過標準方法中規定的重復性要求來考察設備穩定性。檢測結果見表7。

通過表7的計算分析可知，該儀器測定的穩定性標準差和極差均沒有查過標準方法中規定的重復性要求，儀器穩定性好。

表7 儀器的穩定性

2.3.2 兩臺設備分別對6個濃度梯度的玉米樣本進行雙試驗檢測，采用配對t檢驗法比較兩臺儀器的檢測結果是否存在顯著差異。檢測結果見表8。

表8 儀器的臺間差 (單位：μg/kg)

由表8的分析數據可知，td=0.43，查t分布表，t0.05,5=2.5706，td

2.4 設備與產品優化后進行玉米粉中黃曲霉毒素B1不同單位驗證檢測

通過表8～表16的計算分析可知，驗證單位1、驗證單位2、驗證單位3三家驗證單位檢測結果平均值也符合國家標準適用性要求，說明設備與產品穩定性較好。

表9 檢出限與定量限：玉米基質 (單位：μg/kg)

表10 濃度水平1準確性結果：玉米基質 (單位：μg/kg)

表11 濃度水平2準確性結果：玉米基質 (單位：μg/kg)

表12 濃度水平3準確性結果：玉米基質 (單位：μg/kg)

表13 濃度水平1臺間差結果：玉米基質 (單位：μg/kg)

表14 濃度水平2臺間差結果：玉米基質 (單位：μg/kg)

表15 濃度水平3臺間差結果：玉米基質 (單位：μg/kg)

表16 濃度水平2重復性結果：玉米基質 (單位：μg/kg)

2.5 優化試紙卡與其他產品檢測對比

通過表17中優化產品同國外知名品牌產品對同一樣本檢測數據對比，從CV與回收率數據分析，優化產品檢測效果優于進口產品，說明可以取代進口產品。

表17 優化產品與進口產品黃曲霉毒素B1質控品檢測結果 (單位：μg/kg)

3 結論

從黃曲霉毒素熒光定量試紙卡三線與兩線的靈敏度、不同濃度點梯度與重復性等的檢測數據對比可知，三線試紙卡靈敏度更高；不同濃度點分布更合理，且三線試紙卡檢測變異系數CV范圍更小，重復性更高。且通過對三線試紙卡檢測限、檢測范圍、不同基質樣本重復、穩定性等檢測驗證實驗可知，優化后三線試紙卡的準確度、重復性、穩定性等均達到更優的效果，更能滿足檢測需求。另外熒光定量分析儀根據重復性要求，儀器穩定性好且兩臺設備的測定結果之間不存在顯著性差異。

綜上所述，普通免疫層析快檢產品通常采用單檢測線(T線)定量方法，產品研發周期更短，生產工藝更為簡單，成本也更低，但檢測結果的精密度難以控制，導致結果的重復性較差。黃曲霉毒素B1熒光定量快速檢測試紙卡在單T線的基礎上，增加一條矯正T線，與質控線(C線)一起，形成“雙保險”，大大提升了檢測結果的精密度和重復性。