一枝蒿提取物對GERD大鼠肺順應性及食管炎癥因子的影響

李治建，韓夢婷，羅福祥，霍仕霞，竇 勤，買買提·艾力，斯拉甫·艾白

(新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所，烏魯木齊 830049)

胃食管反流病(GERD)系指胃內容物反流入食管，引起不適癥狀和(或)并發癥的一種疾病。GERD氣道高反應如咳嗽、哮喘和支氣管炎等，嚴重影響患者的生活質量，胃食管反流病咳嗽(GERC)是GERD的唯一表現[1-2]。GERC采用常規抑酸治療效果并不理想，質子泵抑制劑(PPIs)的過度使用會造成一系列安全問題[3-4]，因此尋找有效的治療藥物非常必要。一枝蒿(ArtemisiarupestrisL.)是新疆中醫民族醫常用藥，具有清熱解毒、消食健胃、利膽和解蛇毒等功能[5]，具有抗炎、抗變態反應、抗氧化、抗病毒、保肝降酶、調節免疫及健胃促消化等多種作用[6-7]，對急、慢性炎癥及炎性滲出均有明顯的抑制作用，對速發型變態反應有明顯的抑制作用[8]；一枝蒿還具有調節胃腸蠕動的藥理作用[9]，當地民族醫常用其防治各種胃腸道及呼吸道疾病[10]。本研究利用GERD大鼠模型，觀察一枝蒿提取物對GERD所致氣道高反應的改善作用及食管炎癥因子表達的影響，為其開發利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 FM肺功能檢測系統，上海玉研科學儀器有限公司；Nefuqe 15R型高速冷凍離心機，上海力申科學儀器有限公司；GL-88B型漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；K5500型核酸蛋白定量儀，北京凱奧科技發展有限公司；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-21型電泳槽，均購自北京市六一儀器廠；2500型凝膠成像系統，上海天能科技有限公司；Bio-Rad MyCycler Thermal Cycler PCR儀，美國伯樂公司；ABI 7500 Real Time PCR 設備，美國ABI公司。

1.2試藥 一枝蒿提取物：一枝蒿藥材(ArtemisiaRupestrisL.)產自新疆阜康，新疆本草堂大藥房提供(批號20160729)，由新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所藥劑室提取。注射用頭孢呋辛鈉(批號K171211)，國藥集團化學試劑有限公司；胃蛋白酶(CAS號：9001-75-6)和瞬時感受器電位香草酸受體1(TRPV1)拮抗劑(CAS號：138977-28-3)，均購自美國Sigma公司；葡萄糖粉針劑(批號180426)，重慶和平制藥有限公司；5-HT4拮抗劑(CAS號：144625-51-4，批號GR113808)，Abcam公司；瓊脂糖(批號A811BA0014)，生工生物工程(上海)股份有限公司；乙酰甲膽堿(Mch,批號9072217)，北京偉康世紀醫療科技有限公司；Trans2K DNA Marker(批號BM101)，TransZol Up(批號ET111)和AT311逆轉錄試劑盒，均購自北京全式金生物技術有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和溶血卵磷脂酰基轉移酶2(LPCAT2)熒光定量試劑盒(批號208054)，均購自Qiagen凱杰公司；熒光定量引物，烏魯木齊歐易生物醫學科技有限公司。

1.3動物 雄性SD大鼠60只，體質量為180～220 g，購于新疆醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(新)2016-0003。飼養條件為新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所SPF級動物房，每籠大鼠塑料籠盒中飼養動物少于5只，自由飲水攝食。室溫為20～26 ℃，相對濕度為40%～70%，光照黑暗各12 h；實驗前適用性飼養5 d，經過一般行為學觀察，選用健康并符合要求的大鼠進行實驗。實驗中全部操作均遵循新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所實驗動物倫理委員會的相關規定。

2 方法

2.1GERD模型的建立及藥物干預 將一枝蒿藥材粉碎，采用10倍量體積分數為80%的乙醇提取3次，每次1 h，合并3次提取液濃縮成質量濃度為0.6 g·mL-1的一枝蒿提取液。將60只健康SD大鼠隨機分為假手術組、模型組及一枝蒿提取物低、中和高劑量組(1、2、4 g·kg-1)和陽性對照組(TRPV1拮抗劑0.5 μmol·kg-1)。自由飲水飲食7 d后進行造模。除假手術組外，其余各組大鼠均取上腹正中切口，用外徑為4 mm的玻璃棒從胃體部位穿刺入胃，通過幽門至十二指腸，避開腸部各處血管，縫扎玻璃棒外包裹的幽門及十二指腸部分，將玻璃棒穿過賁門處，在內部擴張賁門，使賁門括約肌加劇松弛，縫合胃部后于食管胃交界處縱行切開食管下括約肌，分離至黏膜暴露于視野中。假手術組腹部正中切口在胃部開孔后縫合，暴露腹腔臟器15 min后關腹，關腹前翻動腹腔相關臟器數次，各組均給予頭孢呋辛鈉和葡萄糖0.05 g·mL-1術后支持[11-13]。

2.2大鼠肺順應性檢測 末次給藥后，次日進行肺功能激發實驗。將大鼠麻醉后固定，行氣管插管：切開頸部皮膚，鈍性分離出氣管，暴露氣管后用縫合線穿過氣管，在氣管開倒T形進口，插入氣管插管后行結扎固定。采用密閉的體積描記系統對各組大鼠的氣道反應性進行測定。將大鼠密封于體描箱內，待基線穩定后，使用不同濃度的Mch溶液進行支氣管激發。每次激發結束，待基線恢復穩定再進行第二次激發并檢測。觀察并計算不同Mch濃度激發下其氣道阻力參數的變化情況。肺順應性減少百分比=(激發前肺順應性值-激發后肺順應性值)÷激發前肺順應性值×100%[14]。

2.3大鼠食管組織中TNF-α、IL-1β、IL-6及LPCAT2 mRNA表達量的分析 RNA提取：(1)組織樣本用液氮充分研磨，取樣本50 mg置于離心管中，加入Trizol 1 mL，混勻，室溫放置10 min至組織完全裂解。(2)加入氯仿200 μL，混勻，室溫放置5 min。(3)在4 ℃條件下，以12 000 r·min-1離心15 min。(4)吸取上清液，置于離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，-20 ℃放置30 min。(5)重復步驟(3)，倒掉上清液，加入體積分數為75%的乙醇，使沉淀漂浮，洗滌。(6)重復步驟(3)，倒掉上清液。(7)重復步驟(6)。空管離心，吸盡液體，晾干。用RNase free Water溶解沉淀。核酸蛋白定量儀檢測RNA純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。剩余RNA于-80 ℃保存或直接反轉錄成第一鏈cDNA，用于后續實驗。第一鏈cDNA合成配置體系由Total RNA定量至800 ng，加入Random Primer (0.1 μg·μL-1) 1 μL、2×TS Reaction Mix 10 μL、TransScript@RT/RI Enzyme Mix 1 μL和gDNA Remover 1 μL，最后加入RNase-free Water稀釋至 20 μL。混勻后25 ℃反應10 min，42 ℃反應30 min，85 ℃反應5 s，取出，結束反轉錄實驗。將反轉錄得到的cDNA于-80 ℃保存，用于后續實驗。引物信息見表1。熒光定量PCR體系：2×SYBR Green Select Mix 5 μL、Forward Primer 0.7 μL、Reverse Primer 0.7 μL、ROX 0.05 μL、cDNA 1 μL、RNase-free Water至10 μL；熒光定量PCR程序：預變性95 ℃、2 min，1個循環；變性95 ℃、5 s，40個循環；退火/延伸60 ℃、30 s，40個循環[10]。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

3 結果

3.1一枝蒿提取物對GERD大鼠肺順應性減少百分比的影響 見表2。由表2可知，各組隨著Mch濃度的增加，肺順應性減少百分比逐漸增加。與假手術組比較，當Mch濃度為0.5 mmol·L-1時，各組順應性減少百分比差異無統計學意義(P>0.05)；當Mch濃度為1、2、4、8 mmol·L-1時，模型組肺順應性減少百分比明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，一枝蒿提取物高、中、低劑量組以及陽性對照組肺順應性減少百分比均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

表2 一枝蒿對GERD大鼠肺順應性減少百分比的影響Tab.2 Effect of Artemisia rupestris extract on the percentage of lung compliance reduction in GERD rats

3.2一枝蒿提取物對大鼠食管組織中各基因mRNA表達的影響 見圖1和表3。由圖1可知，PCR產物大小符合檢測基因的片段長度，產物條帶單一。由表3可知，與假手術組相比，模型組大鼠食管組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和LPCAT2表達均顯著升高；與模型組相比，陽性對照組TNF-α表達顯著降低(P<0.05)，一枝蒿提取物高劑量組TNF-α、IL-6和LPCAT2表達均顯著降低(P<0.05)。

表3 一枝蒿提取物對GERD大鼠食管組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和LPCAT2 mRNA表達的影響Tab.3 Effect of Artemisia rupestris extract on expression of TNF-α，IL-1β，IL-6 and LPCAT2 mRNA in esophageal tissue of GERD rats

圖1 PCR產物鑒定電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR product identification

4 討論

神經生理學研究表明，絕大多數食管內的迷走神經感受器激活后可誘發C纖維動作電位[15]。TRPV1在迷走神經C纖維上表達，對辣椒素、酸、溫度或炎癥介質非常敏感，也稱辣椒素敏感受體。TRPV1激活后，可開放離子通道，C纖維興奮后末梢釋放神經肽，可直接刺激咳嗽感受器引發呼吸道癥狀，或通過介導NK1受體表達促使神經生長因子(NGF)、TNF-α等炎癥介質生成增多引起炎癥，從而影響氣道敏感性，間接引發呼吸道癥狀，造成肺順應性降低。對GERC患者進行食管內酸灌注或辣椒素刺激，氣道對刺激的敏感性明顯增高[16-17]。一枝蒿提取物可明顯改善GERD大鼠肺順應性降低的癥狀與改善搭配，緩解氣道敏感性引發呼吸道癥狀。另外，GERD患者體內相關炎癥介質發生變化，特別是促炎因子，現已證明其與GERD的發生、發展密切相關。GERD食管黏膜中 IL-1β、IL-6、白細胞介素-8(IL-8)、血小板活化因子(PAF)和活性氧自由基(ROS)等促炎細胞因子表達水平增加。胃十二指腸內容物包括酸、膽鹽、胰蛋白酶等侵蝕食管和氣管上皮，促炎介質持續高表達便可引起食道、氣管病變，出現GERD相關癥狀及并發癥。白細胞介素-1(IL-1)為促炎細胞因子，構成免疫系統重要組成部分，存在白細胞介素-1α(IL-1α)和白細胞介素-1β(IL-1β)2個亞型，IL-1是多種細胞激活劑，其表達水平的升高可增加腸道、皮膚和其他器官炎性疾病[18]。動物模型和臨床試驗中，回流引起的食管黏膜炎癥中IL-1β有所增加。IL-6是來源于單核巨噬細胞及淋巴細胞發揮多種生物效應的細胞因子，它與炎癥反應的發生密切相關，組織損傷或感染可引起IL-6的釋放，后者誘導急性炎癥的蛋白質合成。TNF-α可刺激并誘導中性粒細胞產生ROS，與酸反流時食道黏膜發生過氧化反應相關。研究顯示，在反流性食管炎演化為Barret′s食管過程中，TNF-α可能起到了一定作用[19]。TNF-α可激活核因子κB (NF-κB)，后者是炎癥和癌癥發生過程中關鍵的調節信號分子。GERD患者的TNF-α表達和NF-κB顯著增加[20]。LPCAT2是一種有效的磷脂類促炎介質和趨化因子，特別是對嗜酸性粒細胞有明顯的趨化作用，能增強嗜酸性粒細胞黏附于血管內皮細胞，可激活多種免疫細胞，促使自身分泌及其他炎癥介質的釋放，包括ROS。在GERD發病機制的研究中，ROS發揮關鍵作用，研究認為GERD是由于胃內容物反流使黏膜上皮細胞出現ROS并發生氧化應激，導致黏膜損害[21]。在食管炎模型和慢性食管炎患者中，酸接觸后的食管黏膜產生并釋放的LPCAT2增加。前期研究表明，一枝蒿提取物具有改善胃腸動力、調節胃酸分泌、促進胃動力的作用[10]。另外，一枝蒿具有明顯的抗炎、抗變態反應作用，對急、慢性炎癥及炎性滲出均有明顯的抑制作用，這與GERD“病在脾胃，胃失和降”引起的胃酸過多、消化不良，以及“濁氣上逆，痰濁”引起的氣道高反應和呼吸系統并發癥表現的炎癥、變態反應癥狀相適應[10]。綜上所述，一枝蒿提取物可改善大鼠GERD所致的氣道高反應，降低GERD大鼠的炎癥因子表達，起到治療GERD的作用。