網絡藥理學-分子對接技術探討白藥子抗肺癌的作用機制

孫杏倩，田 璟，2，梅佳華，普 娟，高家菊，馬云淑，3*

(1.云南中醫藥大學中藥學院，昆明 650500；2.云南白藥集團股份有限公司，昆明 650500；3.云南省高校外用給藥系統與制劑技術研究重點實驗室，昆明 650500)

白藥子是傳統中藥，別名金線吊烏龜，為防己科植物金線吊烏龜(StephaniacepharanthaHayata)的干燥塊根，最早以“白藥”之名記載于《新修本草》[1]。《滇南本草》載“白藥子，味微苦，性平。入脾、肺、腎三經。主治補中益氣，斂肺氣，興陽道，治陽痿，止虛勞咳嗽，傷風日久咳嗽，良效”[2]。白藥子所含化學成分主要為生物堿，包括小檗堿、異紫堇定堿、克班寧、罌粟堿、可待因和頭花千金藤堿等[3-4]。白藥子具有抗癌、鎮痛鎮靜、抗菌消炎、增強免疫、逆轉耐藥和抗心律失常等藥理作用。前期研究表明，白藥子提取物可通過促進骨髓造血而產生提升白細胞數量的作用[5]。白藥子活性成分千金藤素能夠抑制A549細胞增殖，誘導其凋亡，是通過抑制miR-150和miR-182分別下調抑癌基因腫瘤蛋白p53和叉頭狀轉錄因子1(FOXO1)的表達[6]。在非小細胞肺癌細胞中，千金藤素可能會成為一種新型的自噬抑制劑[7]。克班寧也通過阻斷核因子κB (NF-κB)、調節腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導人肺腺癌細胞A549凋亡并抑制其侵襲[8]。

網絡藥理學具有整體、系統和高效的特點，能對“藥物-靶點-疾病”之間的相互關系進行系統的研究，在藥物研究中被廣泛應用[9]。因此，本文基于網絡藥理學，探討白藥子所含主要化學成分的抗腫瘤作用機制，重點分析在肺癌治療中的潛在靶點和信號通路。

1 材料和方法

1.1白藥子化學成分的收集及相關靶點的獲取 中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)是中草藥的系統藥理平臺，利用萬方、維普、知網及PubMed等挖掘檢索白藥子的所有化學成分及靶點。以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18篩選有效化合物，檢索結果用 Excel收集，建立靶點數據庫。

1.2肺癌靶點的獲取及收集 本研究使用Gene Cards數據庫，通過輸入關鍵詞“lung cancer”獲取與肺癌相關的靶標基因。由于以上腫瘤基因相關數量太多，因此在收集數據時需過濾部分數據，設置相關性評分限制≥5分，獲得白藥子與肺癌之間的潛在靶點。

1.3“白藥子-活性成分-關鍵靶點”網絡的構建 采用Cytoscape v3.7.2軟件將白藥子活性成分所對應的靶點基因和肺癌的靶點基因進行匹配，獲得兩者的共同基因，進行擴展分析，從而構建“白藥子-活性成分-關鍵靶點”網絡圖。

1.4關鍵靶點蛋白相關作用網絡的構建 采用STRING數據庫，將白藥子的關鍵靶點導入，網絡節點是蛋白質，邊緣表示預測的功能關聯，根據視圖設置繪制邊。在證據模式下，不同顏色的直線表示不同的相互作用關系證據來源。在置信度模式下，線的粗細表示交互的置信度預測程度[10]。

1.5活性成分與靶點的分子對接 以白藥子活性成分以及目前已報道的有效藥物作為配體，應用PubChem數據庫(查找7個活性成分的三維結構，下載化合物 MOL 結構式作為配體，通過STRING數據庫查找核受體共激活劑2(NCOA2)蛋白質結構作為受體。CB-Dock網站可以預測給定蛋白質的結合位點，并使用基于曲率的新型腔檢測方法來計算中心和大小，并與對接程序Autodock Vina進行對接[11]。

1.6關鍵靶點基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 利用DAVID數據庫對核心靶點蛋白進行GO生物過程分析及KEGG通路富集分析，并構建柱狀圖、氣泡圖及通路圖。

2 結果

2.1白藥子活性成分的潛在作用靶點、潛在疾病的收集 通過TCMSP數據庫檢索的白藥子化學成分共25個，根據藥代動力學方法設置以OB≥30%，DL≥0.18為指標[12]，篩選得到潛在的6個活性成分，見表1。

表1 白藥子潛在活性成分信息Tab.1 Information of potential active ingredients of Baiyaozi

2.2白藥子成分抗癌的潛在作用靶點預測 利用Gene Cards數據庫平臺，檢索“lung cancer”并篩選相關性評分限制≥5的基因，其中得到肺癌、肝癌、乳腺癌和前列腺癌等疾病的潛在靶點4 065個，利用R預言繪制維恩圖，其中白藥子活性成分共有43個，白藥子與肺癌相關的關鍵靶點基因有29個。

2.3“白藥子-活性成分-關鍵靶點”網絡構建分析 見圖1。由圖1可知，在Cytoscape v3.7.2軟件的可視化中，通過29個靶點(綠色)、6個活性成分(淺藍色)、1個疾病(紅色)和1個藥物(黃色)進行拓撲結構分析。白藥子成分中靶點數量最多的前3種活性成分為(S)-(6-甲氧基-4-喹啉)-[(2S，4S，5S)-5-乙烯基奎寧環-2-基]甲醇、罌粟堿和異紫堇定堿，分別靶向26、18、16個靶基因，提示中藥多成分-多靶點的特點。

圖1 “白藥子-活性成分-關鍵靶點”網絡圖Fig.1 Network diagram of "Baiyaozi-active ingredients-key targets"

2.4關鍵靶點基因蛋白質相互作用網絡分析 將白藥子抗肺癌治療的29個潛在靶點基因導入STRING數據庫平臺，選擇物種為人，獲取蛋白質相互作用關系，排除1個游離的無相互作用的蛋白，共包括28個節點、91個邊，見圖2。由圖2可知，綜合數值評分>0.9的相互作用蛋白有26個，其中前5個蛋白分別為核受體共激活劑2 (NCOA2)、類視黃醇X受體(RXRA)、雌激素受體1(ESR1)、多巴胺D2受體(DRD2)、β2腎上腺素能受體(ADRB2)。這些蛋白之間的相互作用在網絡中具有重要地位，靶點基因對于白藥子治療肺癌具有重要意義，具有一定的參考價值。

圖2 白藥子-抗肺癌相關基因的蛋白質相互作用網絡圖Fig.2 Protein interaction network of Baiyaozi anti-lung cancer related genes

2.5分子對接結果 通過PubChem數據庫查找活性成分的三維結構，下載化合物 MOL 結構式，分別導入CB-Dock數據庫進行分子對接。通常認為，Vina評分值表明蛋白質與化合物之間具有一定的結合活性。首先，Vina評分越小，化合物與靶標的結合越穩定。其次，如果空腔的大小接近或大于配體，對接的準確性就會提高[13]。人表皮生長因子受體(EGFR)為肺癌最常見的致病突變，吉非替尼是目前臨床治療EGFR致病突變非小細胞肺腺癌(NSCLC)患者的一線藥物[14]。分子對接結果表明，白藥子的主要化合物對NCOA2蛋白具有良好的結合活性，見表2和圖3。

圖3 白藥子的對接模式圖A.吉非替尼；B.千金藤素；C.(S)-(6-甲氧基-4-喹啉)-[(2S，4S，5S)-5-乙烯基奎寧環-2-基]甲醇；D.可待因；E.小檗堿；F.罌粟堿；G.克班寧；H.異紫堇定堿。Fig.3 Schematic diagram of BaiyaoziA.gefitinib；B.cepharanthine；C.(S)-(6-methoxy-4-quinolyl)-[(2S，4S，5S)-5-vinylquinuclidin-2-yl]methanol；D.codeine；E.berberine；F.papaverine；G.crebanine；H.luteanin.

表2 白藥子相關化學成分與NCOA2蛋白的 Vina 得分Tab.2 Vina scores of chemical components related to Baiyaozi and NCOA2 protein

2.6關鍵靶點基因GO及KEGG通路分析 GO分析見表3。由表3可知，白藥子的88個潛在靶點基因的GO富集排名靠前的生物學功能主要為銨離子結合9個靶點：血清素3 (HRM3)、5-羥色胺受體3A (HTR3A)、乙酰膽堿酯酶 (ACHE)、溶質載體家族6神經遞質轉運蛋白成員4 (SLC6A4)、多巴胺受體D4 (DRD4)、多巴胺受體D3 (DRD3)、溶質載體家族6神經遞質轉運蛋白成員3 (SLC6A3)、DRD2和多巴胺受體D5 (DRD5)；神經遞質受體活性9個靶點：膽堿能受體毒蕈堿3(CHRM3)、HTR3A、阿片受體M1(OPRM1)、腎上腺素受體1(ADRB1)、DRD4、DRD3、DRD2、DRD5和組胺受體H1(HRH1)；兒茶酚胺結合7個靶點：腎上腺素受體2(ADRB2)、ADRB1、DRD4、DRD3、SLC6A3、DRD2和DRD5；G蛋白偶聯受體活性7個靶點：ADRB2、CHRM3、ADRB1、DRD4、DRD3、DRD2和HRH1；離子跨膜轉運蛋白活性6個靶點：鉀電壓門控通道亞家族H成員2(KCNH2)、鈉電壓門控通道α亞基5(SCN5A)、OPRM1、SLC6A4、溶質載體家族6神經遞質轉運蛋白成員2 (SLC6A2)和SLC6A3等，表明白藥子可通過參與調控多種生物學過程而發揮抗肺癌的作用。

表3 白藥子的GO分析Tab.3 GO analysis of Baiyaozi

KEGG通路分析見表4。由表4可知，白藥子的生物堿成分對抗腫瘤的信號通路主要為鈣離子信號通路、甲狀腺激素信號通路、雌激素信號通路、PPAR信號通路、cAMP信號通路及癌癥通路等。鈣離子(Ca2+)作為一種常見的信號轉導因子，在細胞分裂、生長、死亡過程中起到重要作用，在Ca2+的刺激下，通過一系列信號途徑激活相應作用蛋白，可調節人體的肌肉舒張，參與骨的形成，調控細胞(包括癌細胞)的增殖、侵襲、轉移和凋亡等[15]。甲狀腺激素信號通路的關鍵基因，包括4個合成酶甲狀腺過氧化物酶(PERT)、2個代謝酶脫碘酶、1個甲狀腺激素受體(TR)[16]，可調節多種生理過程，包括細胞生長、胚胎發育、分化、代謝和增殖。雌激素是多效類固醇，除了介導動態平衡的生物學機制外，還在多種癌癥的發生和惡性進展中發揮作用，在經典和非經典激素敏感型癌癥中可刺激細胞的發育、增殖、遷移和存活[17-18]。其中與癌癥中小細胞肺癌、非小細胞肺癌和甲狀腺癌等腫瘤密切相關，相關文獻也證實了白藥子的生物堿成分可抑制腫瘤的生長。揭示白藥子的活性成分分布于不同的通路，可通過各通路協調發揮抗癌作用，也可作為未來研究白藥子抗腫瘤機制的方向。因此，初步推測白藥子的生物堿成分可通過調控鈣離子等信號通路介導的信號轉導，抑制肺癌細胞的生長。

表4 白藥子的生物堿成分抗肺癌關鍵靶點的KEGG代謝通路富集分析Tab.4 Enrichment analysis of the KEGG metabolic pathway of the alkaloid composition of Baiyaozi against the key targets of lung cancer

白藥子的生物堿成分抗肺癌信號通路見圖4。由圖4可知，白藥子的生物堿成分抗肺癌(小細胞肺癌和非小細胞肺癌)通過預測涉及的信號通路為磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路、腫瘤蛋白p53、NF-κB信號通路等，主要富集的癌基因與抑癌基因有MYC基因(癌基因)、維甲酸(RA)、FHIT基因、p53、視網膜母細胞瘤(Rb)基因以及磷酸酶和肌腱蛋白同源(PTEN)基因等。這些靶點和信號通路與癌細胞的增殖、侵襲、轉移以及凋亡癌細胞的增殖、凋亡密切相關。研究表明，千金藤素以劑量依賴的方式抑制H1299和A549細胞的生長，與活性氧(ROS)的產生和線粒體膜電位的消耗有關，此外還可通過BCL2-Associated X的蛋白質(Bax)的上調、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)的下調以及半胱天冬酶3(caspase-3)和聚ADP-核糖聚合酶(PARP)激活來觸發非小肺癌細胞的凋亡[19]。通過白藥子的活性成分、靶點和疾病的關系，可為后期的實驗研究提供新思路。

圖4 白藥子的生物堿成分抗肺癌的信號通路途徑Fig.4 The signal pathway of Baiyaozi′s alkaloids against lung cancer

3 討論

中醫藥治療腫瘤有獨特的優勢，在中醫理論中，與致瘤因子相似的熱毒是引起腫瘤的主要原因之一。現代研究表明，清熱解毒藥治療腫瘤是中醫方劑的重要組成部分[20]。千金藤具有清熱、排毒、抗菌消炎及提高免疫等功效[21]，現代研究發現這些應用與抗腫瘤密切相關。隨著分子生物學和基因組技術的發展，中藥或單一的化學成分可借助網絡藥理學及多個復雜程序，使藥物從分子和細胞水平轉化到組織和機體水平。然而，網絡藥理學方面仍然存在局限性，如千金藤素已被證實具有抗肺癌的作用，但在篩選過程中部分主成分的數據被剔除，導致分析的成分不夠全面，化合物間相互作用及藥動學藥效學的研究不夠深入，還需進行多個藥理和臨床研究加以驗證。

綜上所述，白藥子治療肺癌主要通過6種活性化合物、88種潛在靶點和20種信號通路，其中銨離子結合受體、神經遞質受體和兒茶酚胺受體等為主要候選靶點，對神經活性配體-受體相互作用、鈣離子信號通路和多巴胺能神經突觸進行網狀綜合調節為白藥子抗腫瘤的主要調節機制。推測白藥子可通過神經介質及激素來調節生理過程，在化療并發癥期，可通過轉變機體激素及腫瘤細胞代謝，增強腫瘤細胞的敏感性，從而影響癌細胞的生長、分化、代謝和增殖。基于網絡藥理學等方法研究白藥子的生物堿成分對肺癌的具體作用靶點及機制以及未來臨床運用中藥治療肺癌等疾病具有重要意義。