腦癱差異表達基因生物信息學分析及腦癱核心驅動基因篩選

曾杰，徐林，趙亞林，鄧博文，于睿欽，趙毅，穆曉紅

北京中醫藥大學東直門醫院，北京100700

腦性癱瘓（簡稱腦癱）是最常見的兒童致殘性疾病，是發育中的大腦中出現非進行性損傷引發永久性的運動和姿勢發育障礙，進而導致患者活動受限，其中運動功能障礙是腦癱的核心癥狀。歐洲部分國家數據顯示，腦癱總體患病率為2.08‰，其中極低出生體質量兒的患病率為42.4‰［1］，加拿大兒童腦癱患病為2.2‰，受到人口預期壽命延長的影響，腦癱患病率仍在緩慢增加［2］。我國部分地區隨機抽樣調查顯示，0～6 歲兒童腦癱的患病率為 2.37‰［3］。腦癱給醫療保障系統和家庭造成巨大壓力，同時腦癱患者自身生活質量也受到極其嚴重的影響。目前尚無能夠治愈腦癱的治療方法，對腦癱做到早期診斷和干預，探索腦癱相關的差異表達基因和治療靶點，對于降低腦癱發病率、改善患者預后和降低殘障率具有重要的意義。近年來，隨著基因芯片和高通量測序技術的快速發展，研究者能夠快速實現轉錄組和基因組的全貌細致分析，有力推動了生命科學的發展進步。隨著針對腦癱基因表達譜等相關研究的逐年增加和各類公共數據庫的建立，可通過生物信息學方法對腦癱進行更深層次的研究，進而拓展對腦癱病理機制的認識。本研究通過檢索國內外文獻，獲取腦癱的差異表達基因，在此基礎上進行生物信息學分析，并篩選出腦癱核心驅動基因，為下一步研究提供方向。

1 資料與方法

1.1 腦癱差異表達基因的獲取 通過檢索Pubmed（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/pubmed/）數據庫，檢索與腦癱差異表達基因相關的文獻，檢索式為：（cerebral palsy ［MeSH］） and （polymorphism［MeSH］or genotype［MeSH］or alleles［MeSH］）not（neoplasms［MeSH］），截至2020 年10 月5 日共檢索到英文文獻120 篇，通過閱讀文獻摘要，收集與人類相關的遺傳關聯研究，其后審閱選定文獻的全文，確保其內容支持結論，最后納入英文文獻44 篇。同時，在中國知網檢索獲取腦癱差異表達基因相關文獻，檢索主題詞為“腦性癱瘓”“基因”“易感性”“多態性”，進行模糊匹配，排除綜述、動物研究以及與腦癱無關的研究后，最終得到有效中文文獻12篇，閱讀全文并獲取文章中的腦癱差異表達基因。

1.2 腦癱差異表達基因的生物信息學分析

1.2.1 腦癱差異表達基因的GO 功能富集分析利用 WebGestalt（http：//www. webgestalt. org/）對腦癱差異表達基因進行GO功能富集分析，以此探索參與腦癱的主要生物學過程、細胞組分、分子功能，以錯誤發現率（FDR）＜0.05的條目為顯著富集標準。

1.2.2 腦癱差異表達基因的KEGG 信號通路分析 將腦癱差異表達基因上傳至ToppGene（https：//toppgene. cchmc. org/）進行 KEGG 信號通路分析，采用benjamini-hockberg 算法對顯著性結果進行多重檢驗的校正，選擇KEGG 數據庫對腦癱差異表達基因參與的信號通路進行注釋，以FDR＜0.01作為顯著富集的通路。

1.2.3 腦癱差異表達基因的通路串話分析 通路串話分析基于以下假設：如果兩條信號通路之間共享2 個及以上腦癱差異基因，那么這兩條信號通路即具有通路串話關系。為準確描述每兩條任意信號通路對之間的基因重合關系，本研究利用杰卡德相似系數（JC）和重疊系數（OC），將JC 和OC 的平均值作為衡量兩條通路間基因重復關系的指標，然后利用Cytoscape 軟件將具有串話關系的網絡導入并進行可視化。以節點代表信號通路，網絡中與某個信號通路具有串話關系的通路越多，則該信號通路的節點越大；以邊代表通路對之間的串話關系，通路對之間重合基因越多，則連接兩條通路的邊越粗。

1.3 腦癱核心驅動基因的篩選 將腦癱差異表達基因上傳至 STRING 11.0 軟件（https：//string-db.org/），構建蛋白質互作網絡（PPI），隨后將數據導入Cytoscape 軟件，利用該軟件中的cytoHubba 插件并使用最大團中心性（MCC）方法，篩選出蛋白間相互作用對數排名前10的差異表達基因，即為腦癱核心驅動基因。

2 結果

2.1 腦癱差異表達基因的獲取結果 通過Pubmed和中國知網數據庫檢索得到298 個腦癱差異表達基因 ，包 括 NOS2、IL1B、APOE、TUBA1A、SCN8A、KDM5C、AGAP1、KDM7A、MAST1、NAA35、IL6、SLC1A2、F5、TLR4、COL4A1、PRKG2等基因。

2.2 腦癱差異表達基因的生物信息學分析結果

2.2.1 腦癱差異表達基因的GO 功能富集分析結果 GO功能富集分析結果顯示，腦癱差異表達基因在生物學過程方面主要與免疫應答、防御反應、對含氧化合物的反應、細胞因子介導的信號通路、對生物刺激的反應、對其他生物體的反應、細胞活化、免疫反應調節、免疫系統進程調節、細胞對細胞因子刺激的反應、神經發生、神經元的產生等有關，在細胞組分方面主要與軸突、突觸后膜、突觸、細胞膜的固有成分、細胞連接等有關，在分子功能方面主要與蛋白聚糖結合、膠原結合、抗原結合、抗氧化活性、細胞骨架的成分、細胞因子受體結合、受體-配體活性等有關。

2.2.2 腦癱差異表達基因的KEGG 信號通路分析結果 最終獲得42 條顯著富集的通路，涉及免疫系統和炎癥反應的信號通路有Th17 細胞分化、Toll 樣受體信號通路、NOD 樣受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、NF-κB信號通路、Th1和Th2細胞分化、趨化因子信號通路、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、T 細胞受體信號通路、血管內皮生長因子信號通路、抗原處理和呈遞等，涉及神經系統的信號通路有軸突導向、PI3K-Akt 信號通路、HIF-1 信號通路、縫隙連接等。此外，還富集得到一些感染性疾病如百日咳、丙肝、麻疹、美洲錐蟲病等和炎癥性腸病、類風濕性關節炎、I型糖尿病、癌癥、肌萎縮性側索硬化癥等疾病的信號通路。KEGG 信號通路分析結果也表明，腦癱的病理機制涉及到免疫系統、神經系統等多系統和多途徑的信號轉導過程。

2.2.3 腦癱差異表達基因的通路串話分析結果 42條信號通路中經串話分析最終保留41條通路，即41 條信號通路中任意一條都與其他若干條信號通路共享2個及以上的基因。腦癱差異表達基因的通路串話關系網絡見圖1。由圖1可見，該網絡包括41 個節點、477 條邊，其中T 細胞受體信號通路、IL-17 信號通路、細胞因子和細胞因子受體相互作用、腫瘤壞死因子信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、癌癥中的蛋白多糖、Th17細胞分化、NOD 樣受體信號通路、Toll 樣受體信號通路、NF-κB 信號通路、PI3K-AKT信號通路、HIF-1信號通路與其他的通路之間存在較多的串話關系，可能在腦癱的病理機制中發揮重要作用。

圖1 腦癱差異表達基因的通路串話關系網絡

2.3 腦癱核心驅動基因的篩選結果 獲得一個包含263 個節點、1585 條邊的PPI 網絡，其中蛋白間相互作用對數排名前10 的基因是IL-6、TNF、IFNG、CXCL8、TLR4、ICAM1、IL-4、IL-1β、CCL5、PTGS2，腦癱差異表達基因的PPI 網絡見圖2。

圖2 腦癱差異表達基因的PPI網絡圖

3 討論

目前尚不完全清楚腦癱發病的具體病理機制，一般認為腦癱的病因涉及產前、產中和產后的多個關節，與缺氧、早產、感染、黃疸、低出生體質量、新生兒腦病及遺傳因素等有關［4］，缺氧是腦癱的主要病因［5］。借助基因組學、分子遺傳學、蛋白組學等技術手段，人們對腦癱的認識和研究不斷推向深入，遺傳因素和易感基因也走進了研究者的視野，成為腦癱研究的熱點領域。遺傳因素可能會改變圍產期炎癥和神經發育障礙的易感性，誘導腦癱等神經發育障礙性疾病的發生。此外，出生前后的環境暴露可影響嬰兒的表觀遺傳標記物，生命早期的表觀遺傳標記物能夠預測數年后的神經發育結果。基因靶向精準治療已成為多種惡性腫瘤治療的重要手段，基于表觀遺傳途徑實現基因層面的調節也可能為腦癱等疾病的新治療策略提供有希望的方向［6-7］。

在本研究中，通過分析中英文相關文獻，提取腦癱差異表達基因298 個，并對該基因集進行富集分析和PPI 網絡構建。GO 功能富集分析結果顯示，差異表達基因主要匯集于免疫應答和神經發生等生物學過程，涉及到的細胞組分主要有軸突、突觸后膜等，分子功能主要涉及蛋白聚糖結合、膠原結合等；KEGG 信號通路分析表明，差異表達基因富集于與免疫系統、炎癥反應和神經系統相關的信號通路，如Th17細胞分化、Toll樣受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、NF-κB 信號通路、軸突導向、PI3K-Akt 信號通路、HIF-1 信號通路、縫隙連接等。對富集到的信號通路進行串話分析證實，T 細胞受體信號通路、IL-17 信號通路、細胞因子和細胞因子受體相互作用、腫瘤壞死因子信號通路等與其他信號通路具有較明顯的串話關系。

本研究還通過構建差異表達基因PPI 網絡，獲得10 個核心驅動基因，分別是IL-6、TNF、IFNG、CX?CL8、TLR4、ICAM1、IL4、IL-1β、CCL5、PTGS2 等，說明上述基因可能在腦癱發病的蛋白表達調控機制中扮演了重要角色。研究［8］發現，IL-6、IL-1β、IL-8、TNF-α是最能預測神經發育損傷的蛋白質生物標記物。IL-6 是腦室周圍白質軟化癥（PVL）相關病變的獨立預測因子，可增加早產兒對不良神經發育結局的易感性［9-10］，IL-6 和 IL-8 均可明顯增加腦癱的患病風險［11］。此外，腦癱患者血漿TNF-α 水平明顯高于正常對照組，且TNF-α 水平與疾病嚴重程度顯著相關［12］。IL-1β 在缺血缺氧性腦病的神經炎癥機制中起關鍵作用。有研究［13］證實，在 IL-1β 基因啟動子的511 位點攜帶單核苷酸多態性（SNIP），以及在NOS2A 啟動子中CCTTT 微衛星的擴增，可能使患兒在缺血缺氧性腦病后更容易發生腦癱。TLR4屬I型跨膜蛋白，通過MyD88 依賴和非MyD88 依賴性途徑被活化，其后激活巨噬細胞和內皮細胞，促進炎癥和免疫調節因子基因表達。有臨床研究［14］顯示，TLR-4多態性有潛在的神經保護作用，可能與腦癱風險降低有關。IFNG 具有重要的免疫調節功能，表現為當病原體入侵宿主時，IFNG 激活巨噬細胞使之殺滅病原體，形成免疫應答的第一道防線［15］。CCL5屬于C-C趨化因子家族，可將白細胞募集到炎癥部位中起抗炎作用。在大腦中，CCL5能夠誘導少突膠質細胞系oli-neu細胞增殖，促進髓鞘形成，調節星形膠質細胞分化，抵抗神經毒素發揮神經保護作用［16］。ICAM1能夠促進白細胞經內皮遷移到炎癥部位，破壞血腦屏障，CAM1 的上調發生在多種疾病中，包括自身免疫性疾病、癌癥、心血管疾病、神經系統疾病和炎性疾病等。在炎癥條件下，ICAM1 升高會增加患兒腦白質受損和罹患腦癱的風險［11］。PTGS2被認為是緩解疼痛和治療炎癥的靶標［17］，在神經炎癥反應中，星形膠質細胞和小膠質細胞中PTGS2 的表達顯著增加，PTGS2 作為神經毒性介質，可能是導致神經變性、精神疾病和癲癇的病理因素［18］。

綜上，本研究通過檢索文獻收集腦癱差異表達基因數據，運用生物信息學方法，對差異基因進行富集分析發現，免疫應答等生物學過程和Th17細胞分化等信號通路可能參與了腦癱的發病機制；通過構建差異表達基因PPI 網絡，獲取可能參與腦癱發病的核心驅動基因。上述靶點和信號通路可能在腦癱的發生發展過程中有重要的影響和作用，值得在下一步的研究中進行深入探討。