1 702例早孕絨毛細胞培養及細胞遺傳學分析

郝娜，田曉彤，周京，戚慶煒，蔣宇林，周希亞，劉俊濤

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院產科中心，北京 100730)

絨毛取樣活檢術(Chorionic villus sampling，CVS)是一種早孕期(11～13+6周)介入性產前診斷技術，有助于早期診斷和早期處理，是預防出生缺陷的重要手段[1]。染色體核型分析可以有效檢出染色體數目異常，以及大片段的缺失、重復、易位、倒位等結構異常，是細胞遺傳學產前診斷的金標準[2]。本文回顧性分析了北京協和醫院1 702例早孕期絨毛細胞培養及染色體核型分析結果，對產前診斷指征和異常結果之間的關系進行討論，并對絨毛取樣活檢術在產前診斷中的應用進行總結。

資料與方法

一、研究對象

選取2002年4月至2019年9月在北京協和醫院產前診斷中心行超聲引導下絨毛活檢術的早孕期患者。

納入標準：(1)孕11～13+6周；(2)資料完整；(3)產前診斷指征包括高齡妊娠、單基因病孕史、超聲異常(胎兒頸部透明層增厚、頸部水囊瘤、鼻骨缺失、全前腦，巨膀胱等)、夫妻雙方之一有易位或倒位等染色體異常、孕產史不良(不明原因流產、胎停育、畸形兒孕產史、21-三體等染色體病孕產史等)。

排除標準：孕婦存在出血、感染等產前診斷禁忌癥。

本研究共納入1 702例患者，根據產前診斷指征進行分組，當高齡合并其他指征時，以其他指征為分組標準。

二、方法

1.樣本采集：受檢者在孕11～13+6周時，在超聲引導下，經腹部穿刺，吸取絨毛樣本15～20 mg，挑選合格組織樣本轉移送達實驗室。

2.樣本處理及組織培養：在超凈工作臺中將樣本清洗后移至15 ml無菌離心管中，加入胰酶溶液和膠原酶溶液，置于37℃水浴，2 000 r/min離心，棄上清，加入6 ml羊水培養基(CHANG，美國)，吹打混勻后，接種至兩個細胞培養瓶，置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中靜置培養5～7 d換液，繼續培養24～48 h后，于倒置顯微鏡下觀察克隆狀態以備收獲。

3.收獲及顯帶：培養瓶中加入秋水仙素(上海沃凱)工作液，置于37℃水浴箱中作用15 min。將培養基-細胞混合液倒入15 ml離心管，在原培養瓶中加入0.25%胰酶-EDTA溶液(Gibco，美國)，置于37℃水浴箱中靜置15 min后，輕搖培養瓶，收集細胞，2 000 r/min離心10 min，棄上清，經低滲、固定處理后在適宜的溫濕度(溫度25℃、濕度50%左右)條件下進行滴片。80℃恒溫干燥箱中3 h。胰酶吉姆薩分帶染色。

4.分析使用Cytovision分析系統(徠卡，德國)掃描并采集圖像，計數兩個獨立培養瓶中至少20個細胞，分析5個細胞，核型配對2個細胞[3]。依照人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN)進行分析。

三、統計學分析

應用SPSS 22.0軟件進行數據分析，計數資料以率(%) 表示，采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、一般情況

本研究共納入1 702例早孕期患者，年齡18～50歲，孕周11～13+6周。將染色體核型分析成功的病例按照臨床指征進行分類統計(表1)。

表1 早孕期患者產前診斷指征[n(%)]

二、絨毛細胞培養結果

絨毛細胞培養成功并獲得診斷級別及數量的共1 602例樣本，成功率94.12%，100例因細菌污染(35例)，核型數量不足、帶型欠佳(65例)等原因未得出診斷結果。后續均通過羊膜腔穿刺獲得產前診斷。

三、異常結果檢出情況

1 602例有診斷結果的樣本中檢出異常染色體核型161例，異常率為10.05%(161/1 602)，其中21-三體53例、18-三體39例、13-三體10例、性染色體異常31例、其他常染色體數目異常9例、染色體結構異常17例、多倍體2例。

因單基因病進行產前診斷的464例樣本中，檢出6例異常結果，異常率為1.29%。

超聲異常組中異常率35.14%(110/313)，包括胎兒頸部透明層(nuchal translucency，NT)增厚261例、頸部水囊瘤23例、鼻骨缺失、全前腦或巨膀胱等其他指征29例。將261例涉及NT增厚的病例分為兩組，單純NT增厚192例，檢出異常核型39例；NT增厚合并其他超聲異常或軟指標69例，檢出異常核型43例，組間差異有統計學意義(c2=41.57，P<0.05)。另外17例染色體結構異常包括7例平衡易位、4例倒位，其余6例在染色體斷裂和(或)重接過程中出現了遺傳物質的丟失或重復。產前診斷指征與染色體核型分析異常結果見表2。

表2 產前診斷指征與染色體核型分析異常結果

四、嵌合發生結果

161例異常病例中，純合型異常核型153例，嵌合型異常核型8例，具體分為1例[47，XY，+7/46，XY]、1例[47，XY，+15/46，XY]、1例[47，XY，+21/46，XY]、1例[69，XXY/46，XY]、1例[45，X/46，XY]、3例[45，X/46，XX]，嵌合發生率為0.50%(8/1 602)。8例嵌合病例均進行了羊膜腔穿刺并進行羊水細胞染色體核型分析，除7號染色體嵌合在羊水中未出現外，其余7例均與絨毛結果相符。

五、穿刺后流產情況

1 702例樣本中，穿刺后2周內胎兒出現停育的病例共計5例，流產率為0.29%。

討 論

一、早孕期CVS指征及與異常結果的關系

目前我國介入性產前診斷方式以中孕期羊膜腔穿刺為主，而早孕期CVS可以在孕11～13+6周獲得胎兒樣本進行產前檢測，提前了產前診斷時間，異常結果終止妊娠相對安全[4]。CVS的指征與中孕期羊膜腔穿刺有所不同。我院中孕期羊膜腔穿刺的指征前三位為高齡妊娠、唐氏篩查或無創產前檢測高風險、孕產史不良，而CVS的指征前三位分別為高齡妊娠、單基因病孕史及早孕期超聲異常。

由于我國開展早孕期一站式唐氏綜合征篩查的機構較少，中孕期唐氏篩查高危的孕婦只能進行中孕期產前診斷。無創產前檢測于孕12周開始采血，獲得結果往往已超過CVS孕周，加之絨毛滋養細胞染色體可能與胎兒不一致[5]，因此無創產前檢測高風險孕婦往往也只能接受中孕期產前診斷[6]。高齡孕婦則可以根據自己的意愿，在早孕超聲正常的情況下，自主選擇CVS或羊膜腔穿刺。

在我院CVS的指征中，單基因病孕史占到29.14%。我國單基因病診斷水平近年來提高迅速，單基因病先證者家庭再次妊娠時尋求盡可能早期進行產前診斷。在本研究單基因病進行產前診斷的464例樣本中，除一例合并高齡外，其余均<35歲。經產前遺傳咨詢后，孕婦均要求平行檢測單基因病和染色體病，檢出6例染色體核型異常結果(異常率1.29%)，并且染色體異常形式多樣。使用MLPA和/或測序技術可以檢測出單基因病突變位點，但通過針對目標基因的MLPA或測序無法進行核型診斷。因此，對于此類病人，除了對目標單基因病外，可以在檢測前咨詢時說明染色體核型分析的必要性，建議同時排除常見染色體疾病[7]。

早孕期超聲異常或軟指標異常是我院CVS的第三順位指征。早孕期超聲在我國已得到廣泛開展，超聲異常可能提示胎兒染色體異常，胎兒染色體核型異常發生率也隨著軟指標數量的增多而上升。本研究中超聲異常組染色體總異常率高達35.14%(110/313)，臨床指征中83.39%(261/313)為NT增厚。在NT增厚的261例病例中，69例合并其他軟指標異常，染色體異常檢出率為62.31%(43/69)，高于單純NT增厚的病例(39/192，20.31%)。因此對于NT增厚的病例，尤其是合并高齡妊娠或其他軟指標異常時，建議早孕期CVS檢測[8]。另據文獻報道，頸部水囊瘤是性染色體異常的常見表現形式[9]。本次分析中23例頸部水囊瘤病例中檢出15例染色體異常，其中9例為性染色體異常，均為45，X，與文獻報告符合。

在CVS指征中，夫妻雙方之一染色體平衡易位攜帶雖然僅占1.53%，但絨毛染色體異常比例最高(9/23，39.13%)。夫妻雙方之一的染色體異常均為染色體平衡易位，包括羅伯遜易位。染色體平衡易位在新生兒的發生率為1/500～1/650[10]，其中羅伯遜易位在一般人群中的發生率為1/900～1/1 000，子代獲得的幾率較高，及時發現并診斷，對胎兒出生后成長發育及婚育有指導作用。絨毛染色體核型分析能夠發現5～10 M以上的缺失或重復，而染色體易位造成的微缺失、微重復需要進行全基因組芯片檢測或測序方能獲得診斷[11]。隨著分子檢測技術的發展，夫妻雙方之一染色體平衡易位的患者應建議CVS時進行染色體微陣列分析[12]。

二、CVS取材與絨毛培養

由于CVS取材操作及組織培養的難度遠遠高于羊膜腔穿刺及羊水細胞培養，存在胎盤嵌合、母體污染、組織培養生長緩慢等問題，在我國未能得到廣泛使用。我院自2003年開始進行絨毛培養及細胞遺傳學分析，已形成相對成熟的操作流程及質量控制體系，可以獲得較高的培養成功率[13]。

本研究中絨毛組織培養成功率為94.12%，100例培養失敗的病例中，35例為被污染的病例，多發生在實驗室開展絨毛培養的初期。可能原因：(1)不能除外孕婦存在宮內感染，盡管穿刺前病史采集、測量體溫、血常規檢測可能有助于識別感染，但不能完全排除感染；(2)接種及培養環節的操作問題，絨毛接種前增加了消化細胞環節，處理過程中更需要注意無菌操作。65例核型少的病例多發生于單基因病組，考慮原因可能與樣本取材量相關。因樣本需要同時做基因及染色體分析2項檢測，對標本量需求相對大，此外絨毛取材樣本量還與孕周、胎盤位置、穿刺部位以及操作者的熟練程度有關。

我院CVS相關流產率為0.29%，與國內外文獻報告的數字接近[14]。

三、絨毛樣本細胞遺傳學分析中的特殊問題

絨毛染色體出現嵌合時，既可能同時存在胎兒染色體異常，也可能與胎兒不一致。這與絨毛組織的發育來源有關。CVS所獲得的樣本為早孕期胎盤絨毛，主要為細胞滋養細胞及絨毛間質，并非真正的胎兒組織[15]。絨毛表面和絨毛間質來源于不同的細胞群，前者由滋養層細胞發育而來，后者則由內細胞團分化后的胚外中胚層進一步發育而來。由于來源不同，可能出現絨毛核型與胎兒不符的情況，出現的嵌合現象稱為限制性胎盤嵌合(confined placenta mosaicism，CPM)。按照所累及的絨毛細胞，CPM可以分為3種類型：Ⅰ型CPM，異常的染色體只存在于細胞滋養層細胞中，僅可以在短期培養后見到；Ⅱ型CPM，異常的染色體局限存在于絨毛的間質核心層細胞中，需要經過長期培養后才能見到；Ⅲ型CPM，異常的染色體既存在于細胞滋養層細胞中，也存在于間質核心層細胞中，在短期培養后和長期培養后均可見到[16]。文獻報道中，CVS檢查發現2、3、5、7、10、11、14、16、17-三體嵌合時，胎兒核型往往并無異常[17]。

絨毛嵌合體的另一種可能是胎兒真性嵌合體，即胎兒本身存在兩種或以上的細胞系[18-19]。本研究中8例嵌合病例均進行了羊膜腔穿刺及染色體核型分析，除7號染色體嵌合在羊水中未出現外，其余7例均與絨毛結果相符。

另外，母體細胞污染(Maternal cell contamination，MCC)也是造成嵌合體出現的原因，胎盤結構中羊膜和葉狀絨毛膜構成胎盤的胎兒部分，蛻膜構成胎盤的母體部分，取材時應盡量躲避蛻膜部位，改善進針角度和部位，并在處理絨毛組織之前盡可能剔除蛻膜以避免干擾結果。本研究中嵌合體檢出率低于文獻報道的1%～2%[20]，可能與穿刺指征構成有關。

四、總結

近年來，CVS已經是早孕期介入性產前診斷的常用方法，我院在孕11～13+6周超聲引導下經腹絨毛取材具有較高的成功率，極低的穿刺流產率(2～3/1 000)。絨毛染色體核型制備方法成熟，分析原則有嚴格的質量控制。現階段的產前診斷工作中細胞遺傳學仍為主流檢測方法，可以發現染色體數目和結構異常，對當次妊娠診斷及后續生育指導有顯著臨床意義。CVS尤其適用于單基因病孕史及早孕期超聲異常的產前診斷，當絨毛染色體出現嵌合時，要警惕胎兒與胎盤染色體不一致的情況。