不同時間行早期補救ICSI在IVF完全受精失敗周期中的臨床結局

董娟，夏夢，馬龍，孟慧，林玉婷，蔡令波，劉嘉茵

(南京醫科大學第一附屬醫院臨床生殖醫學中心，南京醫科大學生殖醫學國家重點實驗室，南京 210029)

在體外受精過程中，常規IVF的受精率約為60%～80%，但是在臨床上仍然存在難以預測和不明原因的IVF后完全受精失敗(total fertilization failures，TFF) 以及受精率低下現象，其發生率約為3.5%～20%。特別是完全受精失敗周期，給患者和醫生帶來了不小的經濟壓力和精神壓力，其發生率約4%～16%[1]。對于受精失敗周期患者，臨床上的處理策略是下個周期行ICSI授精或本周期行補救性ICSI。補救性ICSI策略可緩解患者因取消周期帶來的壓力，相對于取消周期更易被患者接受。早期研究是對過夜授精后未排出第二極體的卵母細胞行ICSI授精，也稱晚補救ICSI(Late-ICSI)。盡管有晚補救成功妊娠的報道，但是由于卵母細胞取出后孵育時間過長造成ICSI后胚胎發育潛能低下以及子宮內膜的非同步性，晚補救的臨床結局并不理想，其應用存在較大爭議。

之后的許多報道集中在常規IVF授精后4～6 h行脫顆粒細胞，對受精失敗的卵母細胞行補救ICSI授精，稱之為短時授精結合補救ICSI，也稱早期補救ICSI。早期補救ICSI不僅可以有效避免完全受精失敗或受精率低下，而且減輕了因長時間孵育精子和顆粒細胞代謝產物對卵母細胞潛在的不利影響[2-3]。短時授精中以第二極體排出作為判斷受精的一個重要標志，但對于第二極體排出晚的卵母細胞或因胚胎實驗師對于極體排出與否的判斷經驗不足，太早行補救ICSI會增加多原核的比例；而太晚行補救ICSI時卵母細胞的老化現象會導致胚胎發育潛能低下。因此，補救ICSI的最佳時間窗可能無法準確評估。本研究采取了回顧性分析的方法，分析了短時授精發生完全受精失敗的周期中不同時間行補救ICSI的臨床結局，以期獲得一個較寬的可接受的時間窗來指導實驗室臨床工作。

材料與方法

一、研究對象及分組

本研究數據來源于南京醫科大學第一附屬醫院臨床生殖醫學管理系統數據庫(CCRM)，檢索并回顧性分析2010年1月至2019年4月行常規IVF發生完全受精失敗后行補救ICSI的治療周期。

納入標準：(1)女方年齡≤38歲；(2)均采取短時授精，完全受精失敗后行補救ICSI；(3)夫婦雙方染色體正常；(4)男方精液各項指標符合常規IVF標準；(5)第一周期促排卵；(6)行卵裂期新鮮胚胎移植。

最終有607個周期納入分析。根據加精后行補救ICSI的時間不同分為4組：授精后4～5 h(含5 h)(A組，n=55)；授精后5～6 h(含6 h)(B組，n=219)；授精后6～7 h(含7 h)(C組，n=117)；授精后>7 h(D組，n=216)。

二、研究方法

1.控制性促排卵：采用本中心常規促排卵方案，主要包括長方案和拮抗劑方案。使用促性腺激素后，超聲監測卵泡發育情況及激素水平，調整促性腺激素劑量。當卵泡發育達到一定大小時，注射HCG 5 000～10 000 U，36～38 h后經陰道超聲引導下行取卵術。

2.短時授精結合補救ICSI：取卵獲得的卵泡液經體視顯微鏡檢查收集卵丘卵母細胞復合物，獲得的卵母細胞至少培養2 h后進行IVF授精，精子濃度為3～5×105/ml。精卵共孵育4 h后拆除顆粒細胞，裸化后的卵母細胞立即轉移至卵裂培養液(Cleavage Medium，COOK，美國)中觀察第二極體排出情況。若觀察到所有MⅡ卵母細胞有第二極體排出，判斷為受精；若>70% MⅡ卵母細胞未排出第二極體，判斷為受精率低下；全部MⅡ卵母細胞均未排出第二極體，則判斷為完全受精失敗。在一定時間范圍(4～10 h)內，對于受精失敗和受精率低下的卵母細胞行補救ICSI。ICSI授精后18 h左右觀察受精情況，出現雙原核者為正常受精，授精后第3天進行卵裂期胚胎發育評估。

3.胚胎評分和胚胎移植[4]：在400倍倒置顯微鏡下，根據卵裂球數目、形態和碎片情況對第3天胚胎進行評分，具體分為Ⅰ～Ⅳ級。Ⅰ級：胚胎發育速度正常，卵裂球均勻、數目均等，細胞質均一、無空泡，碎片<5%；Ⅱ級：胚胎發育速度正常，卵裂球均勻或大致均勻，數目均等或大致均等，細胞質均一、無空泡，碎片5%～10%；Ⅲ級：胚胎發育速度大致正常，卵裂球不均勻或均勻、數目不均等或均等，細胞質中有少量空泡，碎片10%～15%；Ⅳ級：胚胎發育速度異常，卵裂球不均勻、數目不均等，細胞質不均一、有大量空泡，碎片15%～50%。評分為Ⅰ級和Ⅱ級的為優質胚胎，Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級胚胎為可移植胚胎。根據第3天胚胎評分和患者雌激素水平及內膜厚度，選擇1～2枚胚胎進行移植，移植后常規黃體支持。對于移植后有剩余胚胎的患者，經其知情同意后行囊胚培養或胚胎冷凍。

4.臨床結局判斷：移植后14 d檢測血β-HCG水平，若β-HCG值為陽性則移植后30 d左右行超聲檢查，超聲下見孕囊及胎心管搏動判定為臨床妊娠。妊娠12周內發生胚胎停育或妊娠物排出則診斷為早期流產。妊娠滿28周且至少有1個存活新生兒分娩判定為活產。

三、統計學分析

結 果

一、患者一般臨床資料比較

4組患者的平均年齡、不孕年限、體重指數(BMI)、基礎FSH、抗苗勒管激素(AMH)比較均無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 患者基本臨床資料比較(-±s)

二、患者的實驗室指標比較

4組患者間正常受精率、多精受精率和卵裂率比較均無統計學差異(P>0.05)；優質胚胎率D組顯著低于其他3組，B組顯著高于C組(P<0.05)，而A組與B、C組比較無統計學差異(P>0.05)(表2)。

表2 患者實驗室結局比較(%)

三、患者移植周期的臨床結局比較

D組的臨床妊娠率、胚胎著床率和每移植周期活產率均低于其他3組，且與B、C兩組有統計學差異(P<0.05)；各組間流產率比較無統計學差異(P>0.05)(表3)。

表3 患者臨床結局比較(%)

討 論

受精是一個復雜而精細的過程，在常規IVF受精中不可避免的會發生受精失敗。受精失敗的原因有許多，如透明帶異常、卵母細胞提前激活、卵母細胞胞質不成熟、精子未能穿透透明帶以及精子缺乏受精激活因子等[5]。補救ICSI的應用大大減輕了患者因受精失敗所致周期取消所帶來的壓力。本研究通過對短時授精結合授精后不同時間行早期補救ICSI相關數據的分析，提示我們對于完全受精失敗周期，在授精后一定時間范圍內(4～10 h)，晚于7 h行補救ICSI的臨床結局較差，因此建議早期補救ICSI不遲于授精后7 h，進一步提出最佳補救ICSI時間窗是授精后5～6 h的初步結論。

補救ICSI最初應用于二十世紀九十年代[6]，是針對過夜授精后未觀察到原核的卵母細胞進行ICSI補救措施，稱之為Late-ICSI。Late-ICSI策略雖然有臨床妊娠報道，但其臨床結局較差[7-8]。普遍認為卵母細胞具有一定的授精窗，錯過最佳授精時機使得受精率不佳；此外，卵母細胞取出后孵育時間過長會老化導致ICSI后的胚胎發育潛能低下以及與子宮內膜的同步性較差。隨后有大量研究集中在IVF授精后4～6 h進行顆粒細胞拆除，通過判斷第二極體排出與否來決定是否進行早期補救ICSI。Chen等[9]在2003年進行了早期補救ICSI的首次報道，發現授精后6 h未排出第二極體的卵母細胞接受補救ICSI得到的臨床結局優于授精后22 h接受補救ICSI，從而提出了早期補救ICSI是避免IVF完全受精失敗的更好策略的建議。

ICSI授精方式在歐洲和美國的一些地區被廣泛使用，但是作為一種侵入性操作，其安全性不容忽視。中國現行法規限定了ICSI授精方式的使用率，臨床醫生對ICSI的指征把控嚴謹，IVF授精方式的使用率明顯大于ICSI授精方式。為了避免占大多數的IVF周期中出現受精失敗，早期補救ICSI措施被認為是一個重要的彌補措施，因此在中國大多數生殖中心應用廣泛和流行。有不少國內的研究證實了早期補救ICSI可以獲得比較理想的胚胎發育結局和妊娠結局[10-12]。短時授精結合早期補救ICSI的關鍵是胚胎實驗師正確判斷卵母細胞第二極體排出的情況。有研究認為，IVF授精后4 h，具有第二極體的卵母細胞中有93.3%的卵母細胞在共孵育14～18 h后顯示正常受精[13]。短時授精提供了一種評估早期受精情況的途徑，然而不同卵母細胞成熟和排出第二極體的時間間隔并非一致，需要延長某些患者卵母細胞的觀察時間；另一方面，有些患者的卵母細胞有極體破碎現象，這會給胚胎師的判斷帶來一定的影響，因此不得不延長判斷時間，甚至延長至原核出現。前者對早期補救ICSI的時間窗提出了一個范圍，后者說明胚胎實驗師的經驗也是至關重要的。

Liu等[14]提出在授精后5～10 h范圍內，早期補救ICSI的臨床結局隨著補救ICSI時間的推遲而降低。本研究在授精后4 h行顆粒細胞拆除，將全部卵母細胞未能排出第二極體的周期判斷為完全受精失敗，早期補救ICSI的時間范圍允許為4～10 h。研究發現正常受精率、多精受精率、卵裂率均沒有隨時間的變化有統計學差異，但是優質胚胎率在授精后7 h補救ICSI組與其他組比較顯著降低，而5～6 h補救ICSI組顯示出了最高的優質胚胎率。授精后7 h補救ICSI組的臨床結局也較差，和其它時間組比較均有統計學差異。值得一提的是，加精后4～5 h補救ICSI組并沒有顯示比5～6 h和6～7 h補救ICSI組更好的臨床結局，推測可能是由于拆除顆粒細胞對卵母細胞的損傷恢復時間不夠所致，需要進一步的實驗證據來支持。

有研究認為短時授精去除顆粒細胞使更多的精子接觸到透明帶，同時影響卵胞漿的成熟，多余的精子進入透明帶從而導致多精受精的發生[15]，短時授精結合補救ICSI中多原核比例的增加對臨床結局有不利的影響[16]。另外，短時授精時胚胎實驗師對判斷第二極體排出與否的經驗欠缺而過早的補救ICSI也會導致多精受精的發生或增加。也有研究認為雖然補救ICSI的多精受精比例升高[17-18]，但是正常受精率、臨床妊娠率并未受到顯著影響[18]。在本研究中，補救ICSI進行時間的早晚對多精受精并無顯著影響，這與之前的報道結果類似[19-20]。

本研究以活產率作為最終觀察指標，分析了4個不同補救ICSI時間組，以期大致明確早期補救ICSI的最佳時間窗。結果提示，在授精后5～6 h行早補救ICSI可以獲得更好的每移植周期活產率，而每移植周期活產率在大于7 h行補救ICSI時顯著降低。胚胎實驗師應準確判斷第二極體排出情況，盡量避免太遲(授精后7 h以上)進行補救ICSI操作，以期獲得較為理想的活產率。本研究為回顧性研究，研究結論還需要更多的前瞻性研究來進一步證實。