移植整倍體胚胎的女性年齡與妊娠結(jié)局的關(guān)系

徐潔，蔡賀，柏海燕，田莉，周寒鷹，薛俠，李偉，師娟子

(西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心，西安 710000)

隨著社會(huì)環(huán)境與生活方式的改變，女性的生育年齡普遍推后，加上二孩政策的開放，高齡孕婦不斷增加。女性年齡是影響輔助生殖技術(shù)治療結(jié)局的重要影響因素。隨著女性年齡的增加，其接受輔助生殖技術(shù)治療的臨床妊娠率逐漸下降、流產(chǎn)率逐漸升高[1]。很多研究表明，隨著女性年齡增加，胚胎染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)逐漸升高[2]。長期以來，染色體重排被認(rèn)為會(huì)顯著增加生育風(fēng)險(xiǎn)和流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，移植染色體正常的胚胎會(huì)保證較高的臨床妊娠率[3]。在早期自然流產(chǎn)中，大約有50%～60%與胚胎染色體異常有關(guān)[4]。因此胚胎染色體異常是導(dǎo)致高齡孕婦臨床妊娠率降低、流產(chǎn)率升高的重要原因。胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT)是一種早期的產(chǎn)前基因診斷方法，利用PGT技術(shù)能夠識(shí)別出染色體異常的胚胎，從而使染色體正常的胚胎得以移植，這項(xiàng)技術(shù)已成為輔助生殖技術(shù)的一個(gè)重要組成部分[5]。隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，越來越多的患者從中獲益。那么，如果先利用PGT技術(shù)篩選出整倍體胚胎，再將其移植給不同年齡的患者，其妊娠結(jié)局是否存在差異，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過分析不同年齡組患者移植了整倍體胚胎后的妊娠結(jié)局，為深入研究高齡孕婦妊娠結(jié)局不良原因提供思路，以期在臨床工作中為患者提供更合理的建議。

材料與方法

一、研究對(duì)象及分組

回顧性分析2015年1月至2019年10月于西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心接受第一周期胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT)篩選及對(duì)應(yīng)的首次凍融胚胎移植(FET)周期患者資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)第一周期接受PGT治療以及對(duì)應(yīng)的首次FET周期的患者；(2)患者從取卵到移植的時(shí)間間隔小于6個(gè)月；(3)PGT助孕指征為夫婦雙方至少有一方的染色體異常、女方復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)、反復(fù)種植失敗(RIF，定義為移植次數(shù)≥3次，并且移植數(shù)目≥3個(gè)囊胚或≥4個(gè)優(yōu)胚)；(4)促排卵方案均采取常規(guī)促排卵方案，以長方案、超長方案、拮抗劑方案為主。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)取卵后第5～6天無囊胚形成或活檢后無整倍體胚胎的周期；(2)合并嚴(yán)重的子宮內(nèi)膜異位癥；(3)合并未經(jīng)處理的輸卵管積水；(4)合并未經(jīng)處理的重度宮腔粘連、多發(fā)性子宮肌瘤；(5)子宮先天發(fā)育異常的患者。

所有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及反復(fù)種植失敗患者均已在我院行RSA/RIF相關(guān)檢查(包括染色體、免疫、凝血、感染等方面)，檢查結(jié)果異常者，在接受輔助生殖助孕治療之前，均已對(duì)癥處理。

共納入符合標(biāo)準(zhǔn)的344個(gè)周期。根據(jù)胚胎移植時(shí)女方年齡進(jìn)行分組：A組(<30歲，n=155)、B組(30～34歲，n=145)、C組(35～37歲，n=31)和D組(≥38歲，n=13)。

二、研究方法

1.治療方法：(1)促排卵、受精：根據(jù)患者基礎(chǔ)卵泡數(shù)以及基礎(chǔ)激素水平，為患者選取合適的促排卵方案，以長方案、超長方案、拮抗劑方案為主。長方案：在排卵后一周使用短效GnRH-a降調(diào)節(jié)14 d，然后開始促排卵；超長方案：在月經(jīng)第2～5天，使用長效GnRH-a降調(diào)節(jié)，30～35 d后開始促排卵；拮抗劑方案：月經(jīng)第2天開始促排卵，當(dāng)主導(dǎo)卵泡≥14 mm時(shí)添加GnRH-a；當(dāng)有≥3枚卵泡的直徑超過17 mm時(shí)，注射HCG，36 h后行B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵。受精方式均采用卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)受精。(2)FET內(nèi)膜準(zhǔn)備方案：月經(jīng)規(guī)律、有排卵且內(nèi)膜正常的女性采用自然周期(natural cycle，NC)；月經(jīng)不調(diào)，無排卵，或雖有排卵但子宮內(nèi)膜薄的女性采用激素替代周期(hormone replacement therapy，HRT)；子宮內(nèi)膜異位癥的女性采用GnRH-a+HRT方案。所有患者均移植1枚D5/D6整倍體囊胚。

2.胚胎檢測(cè)：所有標(biāo)本均采取囊胚期活檢，卵子受精后將在第5～6天形成囊胚，此時(shí)在胚胎滋養(yǎng)層中抽取5～8個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。囊胚活檢方法采用微陣列比較基因組雜交技術(shù)(Array-comparative genomic hybridization，aCGH)或二代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)。46，XN為正常囊胚，非整倍體囊胚為不正常囊胚。

3.觀察指標(biāo)：正常受精率=2PN數(shù)/MⅡ數(shù)×100%；D3胚胎形成率=D3形成胚胎數(shù)/卵裂的受精卵數(shù)×100%；囊胚形成率=形成囊胚數(shù)/D3形成胚胎數(shù)×100%；整倍體胚胎檢出率=整倍體胚胎數(shù)/送檢胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%、活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。臨床妊娠是指在宮內(nèi)或?qū)m外，B超下可見妊娠囊；流產(chǎn)是指小于孕28周的妊娠終止；活產(chǎn)是指孕28周以后出生并存活的嬰兒。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、患者一般資料的比較

4組患者間體重指數(shù)(BMI)、開始促排卵之前基礎(chǔ)FSH值、LH值、E2值、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(AFC)、轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜厚度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4組Gn用量整體上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，再分別進(jìn)行兩兩組間分別比較，A、B組和C組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但該3組Gn用量均顯著低于D組(P<0.05)(表1)。

表1 各組患者一般資料比較(-±s)

4組間在促排卵方案及胚胎檢測(cè)方法的選擇比例上均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組患者促排卵方案及胚胎檢測(cè)方法選擇比例比較[n(%)]

二、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較

4組間正常受精率、D3胚胎形成率、整倍體胚胎檢出率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但隨著患者年齡增加，囊胚形成率逐漸減低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；再分別進(jìn)行兩兩組間比較，A組與B組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余組間(A組與C組、D組；B組與C組、D組；C組與D組)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表3 各組患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較(%)

三、妊娠結(jié)局的比較

4組患者間臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

表4 各組患者妊娠結(jié)局的比較(%)

討 論

國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)將分娩年齡超過35歲的妊娠定義為高齡妊娠。隨著女性年齡的增加，其妊娠能力逐年下降，不孕癥發(fā)生率逐漸升高，尤其當(dāng)女性年齡超過35歲，其生育能力會(huì)快速降低，單周期懷孕幾率下降，成功懷孕的周期拉長，流產(chǎn)率逐漸升高[6-7]。很多原因會(huì)導(dǎo)致高齡孕婦妊娠結(jié)局差。第一，隨著女性年齡增加，其卵巢儲(chǔ)備功能下降，卵母細(xì)胞的數(shù)量下降，卵巢對(duì)促排卵藥物的反應(yīng)性下降。除此之外，卵母細(xì)胞的質(zhì)量也顯著下降，其受精能力以及胚胎發(fā)育潛能均顯著降低，從而導(dǎo)致配子質(zhì)量下降[8]。同時(shí)，隨著時(shí)間推移，男性配偶的年齡也越來越大，雖然男性年齡對(duì)生育能力的影響尚有爭議，但是有研究顯示，男性精子的密度、活力、正常形態(tài)率隨年齡增長呈下降趨勢(shì)[9]。第二，高齡孕婦子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的DNA含量減少，子宮內(nèi)膜上雌孕激素受體減少，這可能會(huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜的容受性降低，從而降低胚胎著床率和臨床妊娠率。第三，高齡孕婦合并盆腔慢性炎癥、子宮肌瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加。子宮肌瘤可導(dǎo)致子宮收縮力改變、影響胚胎種植，也可引起子宮肌壁或子宮內(nèi)膜血管充血擴(kuò)張，從而影響宮腔環(huán)境及胚胎發(fā)育血供，導(dǎo)致受精卵著床率下降。第四，高齡孕婦妊娠期合并癥逐漸增加，例如妊娠期高血壓疾病、妊娠期糖尿病、前置胎盤、胎兒宮內(nèi)生長受限等風(fēng)險(xiǎn)均隨著年齡增加而升高，而活產(chǎn)率逐漸下降[10]。第五，高齡孕婦血管硬化等的風(fēng)險(xiǎn)增加，這可能會(huì)影響子宮局部的血液循環(huán)，進(jìn)而影響妊娠[11]。第六，有研究表示，隨著女性年齡增加，胚胎染色體為非整倍體的風(fēng)險(xiǎn)逐漸增加，高齡孕婦卵母細(xì)胞非整倍體的比例增加，但仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)[12]。這些都會(huì)導(dǎo)致高齡孕婦妊娠結(jié)局不良。

有研究顯示，早期自然流產(chǎn)的標(biāo)本中，大約50%～60%會(huì)表現(xiàn)出某種細(xì)胞遺傳異常，其中最常見的染色體核型是常染色體三體，大約占胚胎染色體異常的50%，其次為X染色體單體和X染色體多體，大約分別占胚胎染色體異常的15%，并且無論夫婦是否存在反復(fù)妊娠丟失的病史，在妊娠時(shí)都有可能發(fā)生胚胎染色體異常[4，13]。胚胎染色體為非整倍體的發(fā)生率與孕婦年齡有關(guān)，其隨著孕婦年齡的增加而增加[14]。因此，人們的評(píng)估重點(diǎn)開始轉(zhuǎn)移，從原先的評(píng)估胚胎形態(tài)，轉(zhuǎn)移到評(píng)估胚胎的遺傳物質(zhì)，PGT技術(shù)也因此產(chǎn)生。我們通過PGT技術(shù)，挑選出整倍體胚胎進(jìn)行移植，以期提高患者的臨床妊娠率、降低流產(chǎn)率。近年來，PGT技術(shù)發(fā)展迅速，該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，但是其安全性仍有爭議。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過胚胎活檢后出生的小鼠與沒有進(jìn)行胚胎活檢出生的小鼠相比，前者神經(jīng)退行性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加[15]。但也有研究表明，與ICSI組相比，PGT組早產(chǎn)兒、低出生體重兒發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)均與之相似[16]。我們知道，在一個(gè)完整的PGT周期中，胚胎需要經(jīng)歷反復(fù)凍融，雖然已經(jīng)有許多研究證明了冷凍胚胎的安全性，甚至有研究表明凍融周期胚胎移植相比于新鮮周期胚胎移植擁有更高的臨床妊娠率[17]，但是多次對(duì)胚胎進(jìn)行凍融是否對(duì)妊娠結(jié)局有不良影響目前尚無定論。有研究者比較了活檢一次凍融一次的胚胎、活檢一次凍融兩次的胚胎、活檢兩次凍融兩次的胚胎的臨床妊娠率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多次活檢與多次凍融均可能降低臨床妊娠率，雖然差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[18]。目前，PGT技術(shù)應(yīng)用于臨床的時(shí)間較短，對(duì)于應(yīng)用該技術(shù)獲得的子代的安全性仍需要進(jìn)一步的隨訪與研究。

眾所周知，隨著女性年齡增加，其妊娠能力逐漸下降，流產(chǎn)率逐漸上升，并且在早期流產(chǎn)原因中，與胚胎染色體異常有關(guān)的占很大比例，那么，如果我們通過PGT技術(shù)檢測(cè)出整倍體胚胎，再給患者移植整倍體胚胎，其妊娠結(jié)局還會(huì)隨著年齡的變化而變化嗎？通過我們中心的數(shù)據(jù)可以看出：首先，不同年齡組患者的一般資料間未見顯著差異，這可能與我們數(shù)據(jù)選擇有關(guān)，一部分高齡、卵巢功能差的患者在門診咨詢過PGT技術(shù)后，自行放棄PGT治療。我們的數(shù)據(jù)顯示，不同年齡組患者在方案選擇上沒有顯著差異，并且Gn總量在前3個(gè)年齡組(<37歲)間也沒有顯著差異。還有一部分患者因?yàn)槁殉矖l件差最終沒能獲卵、形成胚胎/囊胚或囊胚活檢后無整倍體胚胎，被我們排除在外，所以雖然我們沒有刻意將卵巢儲(chǔ)備功能差的患者剔除，但是要求最終能形成囊胚，并且囊胚活檢后有整倍體胚胎的納入標(biāo)準(zhǔn)，就將部分卵巢功能很差的患者排除在外了。其次，不同年齡組患者卵母細(xì)胞的正常受精率、D3胚胎形成率之間未見顯著差異，囊胚形成率隨著年齡增長而顯著降低，整倍體胚胎檢出率隨著年齡增加而降低，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與許多研究報(bào)導(dǎo)不完全一致。分析原因，最可能是樣本量不足、組間樣本分布不均，因?yàn)殡S著年齡增加，女性患者卵巢儲(chǔ)備功能減退，很多夫婦在權(quán)衡利弊后最終放棄了PGT治療，因此我們中心獲得的高齡孕婦 PGT的數(shù)據(jù)很有限，而且這些高齡孕婦的卵巢儲(chǔ)備功能是優(yōu)于同年齡階段其他患者的；并且在囊胚形成過程中，我們已經(jīng)淘汰一部分異常胚胎。最后，隨著孕婦年齡增加，臨床妊娠率、活產(chǎn)率逐漸下降，流產(chǎn)率逐漸升高，但是差異也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這就說明，隨著女性患者年齡增加，胚胎染色體發(fā)生非整倍體的概率逐漸增加，這是導(dǎo)致高齡女性臨床妊娠率低、流產(chǎn)率高、活產(chǎn)率低的主要原因，而PGT的應(yīng)用能夠在某種程度上改善高齡女性的輔助生殖結(jié)局。然而，仍有很多研究提示，高齡孕婦還存在許多其他不利于妊娠的因素[7-12]。我們的數(shù)據(jù)其實(shí)也說明了這一點(diǎn)，觀察我中心數(shù)據(jù)，不同年齡組間臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率的絕對(duì)數(shù)值差異還是很明顯的，之所以沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能是因?yàn)镃組(35～37歲)和D組(≥38歲)樣本量較少，且組間樣本量分布不均；也可能是因?yàn)槠渌蛩貙?duì)妊娠的影響本身比較微弱。當(dāng)然這些都有待于進(jìn)一步研究。

近年來，越來越多的婦女受到不孕癥、自然流產(chǎn)的困擾?？茖W(xué)研究表明，導(dǎo)致女性流產(chǎn)最重要、最常見的因素就是胚胎染色體異常，并且隨著年齡增加，胚胎染色體異常的概率逐漸增加，有數(shù)據(jù)顯示妊娠年齡大于43歲，80%以上的胚胎存在染色體的異常[19]。本研究通過分析不同年齡女性患者移植整倍體胚胎后的妊娠結(jié)局，探究了引起高齡孕婦妊娠結(jié)局差的原因，為高齡不孕癥、反復(fù)妊娠丟失、反復(fù)種植失敗患者的治療提供了某種臨床思路。