基于Label-free技術探討肌少-骨質疏松癥與骨質疏松癥患者骨組織差異蛋白的研究與分析

陳錦成 朱國濤 劉洪文 余博飛 陳彥丞 羅駿 秦曉飛 徐杰*

1.福建中醫藥大學中醫骨傷及運動康復教育部重點實驗室，福建 福州 350122 2.福建醫科大學省立臨床醫學院(福建省立醫院)骨科，福建 福州 350001

“肌少-骨質疏松癥”(sarco-osteoporosis，SO)是當今世界各國老齡化社會正在面臨的突出問題，肌少癥(sarcopenia)的臨床特征是的肌肉強度減退和(或)全身肌肉量占比減少或肌肉機能衰退[1-2]，其病程與自然增齡密切相關。骨質疏松癥(osteoporosis，OP)的臨床特征是骨量逐步縮減、骨結構逐步退化和骨脆性事件增多，其屬于系統性骨病的范疇，OP全身性退化常伴隨的情況是骨折發生率的增高[3]。生物體是由蛋白質構成的，為了在蛋白水平更進一步研究肌少-骨質疏松癥的病理機制，本研究團隊從基因組學逐步深入到蛋白組學相關領域研究，重點開展差異蛋白之間的相互作用機制研究與功能信息分析；本研究團隊采用Label-free定量蛋白組學手段對SO與OP患者骨組織樣品蛋白定量和篩選差異蛋白以及差異蛋白功能分析[4]，為SO致病機制研究奠定基礎，以推動SO生物檢測指標的確定、有效治療藥物和設備開發工作[5]。

1 材料和方法

1.1 納入研究對象的基本資料

隨機抽取在2017年8月至2018年8月期間于福建省醫院骨二科行手術治療的股骨頸骨折病人6例，自愿參與本臨床研究，所有納入的6例研究對象經告知研究方案后均能主動簽署知情同意書；根據生物學重復原則選取SO組與OP組各3例，兩個組的研究對象在族裔、性別和年齡等方面差異沒有統計學意義。

1.2 臨床病例納入及排除標準

臨床病例納入及排除標準見表1。

表1 臨床病例納入及排除標準詳情 Table 1 Details of inclusion and exclusion criteria of the clinical cases

1.3 樣品取樣

在手術臺上切取兩組研究對象骨組織樣品(2～5 g)，然后修剪成邊長0.5 cm的小塊(重量100 mg)裝入小管中，液氮速凍5 min以上，保存于超低溫-80 ℃(Eppendorf)冰箱中，樣品用于后續上機定量蛋白檢測與分析。術中采樣統一由經驗豐富的主任醫師完成；本項目已申請并通過福建省立醫院(本部)倫理委員會研討與批準(審批編號：K2019-03-034)。

1.4 Label-free定量蛋白質組學分析

1.4.1試劑材料與設備：試劑材料與設備見表2。

表2 實驗試劑材料與主要儀器設備 Table 2 Experimental reagent materials and main equipments

1.4.2提取總蛋白：骨組織樣品從超低溫(-80 ℃)冰箱的凍存盒中取出，先在液氮中研磨，然后用1.5 mL的EP 管將研磨好骨組織收集并標記好，加入蛋白裂解混合液(50 mmol/L Tris-HCl、8 mol/L尿素、0.2 %SDS、pH=8)以裂解骨組織樣本；然后開啟并預冷機器至4 ℃，12 000g離心至少15 min，收集上清，移液器吸取4倍上清體積的冷丙酮(含終濃度為10 mmol/L DTT)加入混合，沉淀2 h；再次4 ℃，12 000g離心時間為15 min，收集沉淀；加入800 μL 的冷丙酮(含終濃度為10 mmol/L DTT)重懸沉淀，清洗各種雜質；離心，收集沉淀，超凈臺內風干沉淀。加入600 μL 8 mol/L Urea(50 mmol/L Tris buffer，8 mol/L Urea，pH=8)溶解蛋白。骨組織蛋白樣品進行BCA定量，科研筆記本記錄實驗定量結果。

1.5 蛋白質量檢測

預制備好BSA標準品與待測樣品液體，將G250工作液按試劑說明中微孔板法依次向標準品與待測樣品孔中加入一定量，室溫(37 ℃)孵育5 min，在酶標儀機器上的A595 nm波長位置檢測吸光度值。準備好待測樣品，取出20 μL稀釋好的蛋白溶液，放置在96孔酶標板的其他位置，復孔3個。各組樣品10 %SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮藍對電泳后的凝膠進行處理、洗脫液反復洗脫、蛋白條帶清晰后分析。

1.6 蛋白質酶解

從各實驗樣品中提取蛋白質約100 μg，加入2 μL胰酶(濃度：1 g/L)和500 μL TEAB(100 mmol/L)溶液；快速震蕩和渦旋混勻，微量高速離心；放置在 37 ℃水浴中，過夜酶解16 h左右；次日取出，或凍存-20 ℃，或直接使用。

1.7 質譜上機進行液質檢測

A液(100 %水+0.1 %甲酸)和B液(80 %乙腈+0.1 %甲酸)液體預制備；使用Q ExactiveTMHF-X(Thermo公司，型號：Easy nanoLC 1200)質譜儀進行原始數據質控并上機檢測。

1.8 Uniprot蛋白質數據庫檢索

采用Proteome Discoverer線上軟件(Thermo，版本2.2)開始蛋白質數據的檢索與分析；將SO組和OP組之間蛋白定量差異顯著的 (FC≥2.0，且P≤0.05時，標記為上調表達蛋白；當FC≤0.60，且P≤0.05時，標記為下調表達蛋白) 定義為差異表達蛋白。

1.9 差異蛋白信息分析

使用GO數據庫(http://www.geneontology.org/)分別對SO組與OP組的細胞組分(CC)、分子功能(MF)和生物過程(BP)進行分析；在KEGG軟件(http://www.genome.jp/kegg/)中進行差異蛋白的富集通路重點分析，旨在確定差異蛋白最主要參與哪些代謝途徑和調控哪些相關的信號通路，還可以明確差異蛋白之間相互協調以啟動其生物學行為發揮調控作用。

2 結果

2.1 Label-free質譜數據檢測結果與差異蛋白分析

在SO組和OP組樣品中共篩選出1 395個差異蛋白，定義為差異具有統計學意義的蛋白共30個，上調蛋白篩選出21個，下調蛋白篩選出9個(表3)；對這30個蛋白進行差異分析可知有12個蛋白與代謝途徑密切相關，還有一些重要的差異表達蛋白則參與了細胞氧化還原過程，部分差異表達蛋白可以通過氧化磷酸化途徑激活氧化還原酶活性，這提示了提高機體成骨細胞和成肌細胞抗氧化活性對于延緩SO進程意義重大。此外，細胞骨架結構的重要成分如肌球蛋白輕鏈激酶2、骨調節蛋白前體微管蛋白β-1鏈，這些差異蛋白的激活在調節骨礦化、細胞外基質形成和調節細胞骨架組織以及在肌少癥罹患骨質疏松癥病程進展中扮演重要角色；根據SO組與OP組的蛋白差異分析結果繪制了火山圖(圖1)；并運用聚類熱圖分析在組間比較的上調與下調差異蛋白表達水平(圖2)。

表3 差異顯著的蛋白質詳細信息 Table 3 Details of significantly different proteins

續表3 差異顯著的蛋白質詳細信息Continued table 3 Details of significantly different proteins

注：橫坐標log2值定為差異倍數，縱軸的-log10值則定為P-value，差異表達的閾值用黑色的虛線來表示(臨界值=倍數變化>1.30或<0.83，P值<0.05)；上調的蛋白則是紅色散點來標記，下調的蛋白則是綠色散點來標記，還有差異無統計學意義的蛋白則用黑色散點來標記。圖1 差異蛋白質火山圖Fig.1 Volcano diagram of the differentially expressed proteins

2.2 GO功能富集分析

將篩選出的蛋白質運用GO數據庫[6]進行重點分析其蛋白主要參與的生物過程、分子功能和細胞組分的作用；GO數據庫注釋結果顯示，共3 322個蛋白質有GO注釋結果，其中運用生物信息學方法和專業軟件對鑒定到的差異表達蛋白進行GO富集分析，有856個屬于BP，782屬于CC，1 684個屬于MF；通過注釋結果可知這些差異蛋白可能參與細胞氧化還原穩態、氧化還原過程、氧化磷酸化過程及代謝過程等。

2.3 差異蛋白KEGG富集與功能分析

根據KEGG數據庫[7]的注釋結果，充分運用差異蛋白KEGG富集氣泡圖來梳理注釋結果(圖3)；通過KEGG富集氣泡圖分析可知，SO組代謝途徑與蛋白加工受到影響，從而影響蛋白質合成，最終可能會抑制成肌、成骨分化與增殖；此外，從SO組與OP組比較中得到的GO去除冗余結果的柱狀圖，經過分析也同樣富集到差異蛋白的氧化還原途徑與代謝途徑相關的生物過程功能。

2.4 差異蛋白互作網絡圖分析

在基因測序的同時，越來越多的研究需要借助蛋白質組學來解釋各種生物學現象。本研究團隊使用String DB數據庫系統分析了SO實驗組(TB1)與OP對照組(CB1)之間的特征性蛋白互相關系與作用機制，并且以隨機式互作網絡圖更直觀和形象的呈現出來(圖4)。

注：樣品的聚類是縱向排列，蛋白的聚類則是橫向排列，相似性越高則聚類枝越短；上調的蛋白對應紅色標記，藍色則表示下調的蛋白；蛋白質的表達水平則通過顏色強度來指示。圖2 差異顯著蛋白表達聚類熱圖Fig.2 Clustering heat map of significantly different protein expression

注：TB1表示：SO實驗組；CB1表示：OP對照組；圖中橫坐標Ratio比值為所篩選的差異蛋白個數/共鑒定到總蛋白個數，差異蛋白在通路的富集程度的高低通過Ratio數值的大小反應；-log10(P-value)的值用不同顏色的小圓點表示，當檢驗越具統計學意義和可靠性越大時其值越小；相應通路中差異蛋白的數目通過點的大小來表示，當通路內差異蛋白越多則其相應的點越大。圖3 KEGG富集氣泡圖Fig.3 KEGG enriched bubble chart

注：圖中每一個蛋白用一個節點來表示，互作的蛋白越多則相應的節點越大；蛋白上調表達為紅色節點，蛋白下調表達為藍色節點。圖4 蛋白相互作用網絡圖Fig.4 Diagram of the protein interaction network

3 討論

本研究團隊在SO與OP骨組織樣品差異蛋白質譜研究中采用Label-free 技術(數據掃描模式：DDA)篩選與鑒定出過氧化物酶-1、潛在轉化生長因子β結合蛋白1亞型X1、線粒體轉錄因子A (mitochondrial transcription factor A，TFAM)、細胞色素C氧化酶等4個差異蛋白，并通過結合文獻資料梳理上述4個差異蛋白的具體作用機制和調控功能，旨在為進一步闡明肌少-骨質疏松癥病理演變過程和臨床診治提供更多的基礎研究數據。

顏曉芳等[8]研究發現當成骨細胞Wnt通路相關蛋白表達被抑制時，過氧化物酶增殖物激活受體γ(peroxisome proliferatorsa- ctived receptor γ，PPARγ)的活化水平會受到一定影響。老年性肥胖、高糖疾病狀態下機體可引起PPARγ表達的上調，而PPARγ的激活伴隨著Wnt相關蛋白的表達抑制，進而影響了成骨細胞骨形態發生蛋白等功能蛋白表達水平的降低，導致骨形成減少，最終加速OP的進程。自然增齡往往伴隨著脂質氧化過程相關的PPAR基因調控功能的下調，機體成肌細胞的脂肪氧水平也隨之下降，進而導致ATP合成縮減，最終影響肌肉的收縮功能[9]。邢麗等[10]也研究發現機體脂肪細胞的分化、胰島素抵抗及骨代謝水平的變化和PPARγ表達水平密切相關。

轉化生長因子-β1 (transforming growth factor-β1，TGF-β1)可以介導骨形態發生蛋白表達進而誘導成骨分化與骨形成，其可能是通過增強成骨細胞增殖能力與促進細胞分化成熟，以及增強機體基質鈣化能力以加速修復骨損傷；TGF-β1的促細胞分裂與增殖作用的強弱會影響機體的間充質細胞、軟骨細胞和成骨細胞數量的增減，這為骨組織再生修復提供了更多的物質基礎[11]。Joyce等[12]研究發現TGF-β1可促進成骨細胞Ⅰ型膠原蛋白形成，以加快骨缺損機體自我修復。

線粒體轉錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)與骨骼肌萎縮存在密切關系，TFAM的過表達對緩解肌萎縮有著積極的作用，宋銀娟等[13]發現TFAM過表達會使線粒體內活性氧的產生減少，以保證線粒體的調控功能正常發揮[14]。Tasaki等[15]研究發現TFAM作為與骨骼肌萎縮重要的蛋白質分子之一，運動會促進TFAM表達，以提高線粒體的調控能力，從而防治肌少癥。運動具體通過哪些分子機制以調控TFAM的表達，從而達到預防和治療肌少癥的問題仍有待深入研究。此外，歐陽劍鋒[16]研究發現OP疾病狀態下往往伴隨氧化應激水平的高表達，此時OP患者體內TFAM 表達水平會有所降低，一但缺少TFAM保護，被氧化損傷的線粒體轉錄DNA在機體內的數量將會增加，此時，缺少了修復酶對損傷線粒體轉錄DNA的逐步修復，則線粒體調控作用失常，由此證明OP的演變過程可能和TFAM表達下調引起的線粒體轉錄DNA 拷貝數的多少有重要關聯。

細胞色素氧化酶(cytochrome oxidase，COX)主要參與細胞的氧化磷酸化過程，并且在機體內會影響細胞氧化磷酸化對其相對應下游靶基因的調控作用[17]。眾所周知，氧化代謝過程是維持骨骼肌功能所必需的，而這種代謝的重要成分是COX，即線粒體電子傳輸鏈的13個亞基末端復合物[18]。李穎等[19]研究骨骼肌與OP的關系，創新性提出肌肉線粒體內通透轉換孔(MPTP)的表達水平可能與OP病理過程有密切關系，研究中發現OP患者肌肉中MPTP的通透性明顯偏高，其中MPTP通透性水平高低受COX的活性介導；因此，保持COX的活性對于有效控制MPTP的變化意義重大，可以有效實現延緩細胞的衰老進程。此外，劉慶浩[20]發現COX的活性與肌細胞的凋亡有一定聯系，而肌細胞的衰退有可能加速肌少癥的到來并誘發骨質疏松，綜上，研究者認為COX的活性與SO的發生發展有密切關系，但其復雜的分子機制需深入研究。

SO屬于肌肉-骨骼系統疾病，差異蛋白PPARγ在維持成骨細胞與破骨細胞的平衡體系中發揮重要作用。TGF-β1參與調控骨形態發生蛋白表達過程，可為機體骨骼修復過程提供必要的物質基礎。TFAM的主要作用是參與了氧化應激過程，深入研究其是否參與氧化和抗氧化的疾病過程將為揭示OP的氧化應激具體分子機制提供更多可能；此外，COX參與了骨骼肌功細胞的氧化代謝過程，并且在肌少-骨質疏松癥骨組織樣品中存在顯著差異表達，提示其可能也同時參與了OP的成骨細胞氧化代謝過程。

綜上，本研究團隊運用Label-free質譜篩選技術在SO上進行蛋白質譜數據采集與研究分析，并且初步篩選出過氧化物酶-1、潛在轉化生長因子β結合蛋白1亞型X1、線粒體轉錄因子A、細胞色素C氧化酶等4個差異顯著的蛋白，這些差異蛋白可能參與調控著SO發病的全過程；此蛋白質譜研究結果將為后續開展有關肌少-骨質疏松癥細胞或動物的實驗研究提供了更多思路與方向。