調(diào)節(jié)神經(jīng)元CREB磷酸化水平對(duì)APP和γ分泌酶的影響

邸暢 李國萍 羅浩丹 畢珊 孫欣 陳紹春，3

(昆明醫(yī)科大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，云南 昆明 650500；2第三附屬醫(yī)院頭頸外科；3康復(fù)學(xué)院)

γ分泌酶復(fù)合體是阿爾茨海默病(AD)中形成β淀粉樣蛋白(Aβ)的關(guān)鍵酶，它通過對(duì)β分泌酶切割A(yù)β前體蛋白(APP)形成的含有99個(gè)氨基酸的C端片段(C99)再切割形成Aβ〔1〕。而γ分泌酶復(fù)合體中起主要催化作用的部分是早老素(PS)1蛋白，PS1在早老素增強(qiáng)子(PEN2)的存在下會(huì)被水解為兩段而發(fā)揮對(duì)C99的剪切作用〔2〕。當(dāng)用抑制劑γ-分泌酶抑制劑抑制γ分泌酶的功能時(shí)，PS1的表達(dá)量反而升高〔3〕。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(CREB)一直認(rèn)為是形成和維持長期記憶的關(guān)鍵蛋白，它的表達(dá)量及磷酸化水平一直被作為記憶能力變化的指標(biāo)，而在AD中長期記憶的喪失是患者生活不能自理的重要原因〔4〕。Aβ以單體形式存在可以增加CREB的產(chǎn)生，而Aβ產(chǎn)生的低聚物及老年斑是破壞神經(jīng)元導(dǎo)致癡呆的重要原因〔5〕。Aβ1～40與Aβ1～42的比例失衡被認(rèn)為是導(dǎo)致淀粉樣變性及老年斑的關(guān)鍵原因〔6〕。當(dāng)突變激活CREB的上游基因啟動(dòng)子表達(dá)，CREB的表達(dá)量上升的情況下，PEN2蛋白的表達(dá)量隨之上升〔7〕。而抑制蛋白激酶(PK)A-CREB-腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)通路時(shí)大鼠表現(xiàn)出長期的空間學(xué)習(xí)和記憶障礙〔8〕。既往研究多將CREB作為評(píng)價(jià)記憶能力變化的分子指標(biāo)，而很少將其作為AD發(fā)生發(fā)展和防控的初始因素進(jìn)行研究。本文旨在通過使用CREB激動(dòng)劑和抑制劑干預(yù)CREB在人神經(jīng)元樣細(xì)胞株SY5Y中的磷酸化水平，探討CREB磷酸化水平的變化對(duì)APP及γ分泌酶復(fù)合體的影響。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司； 0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素購自美國Hyclone公司；Forskolin和H 89 2HCL購自美國CST公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 空載體SY5Y細(xì)胞株(Vector-SY5Y)、過表達(dá)Gαq的SY5Y細(xì)胞株(Gαq-SY5Y)、過表達(dá)APP的SY5Y細(xì)胞株(APP-SY5Y)委托上海漢恒生物科技有限公司構(gòu)建，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2濃度。

1.2.2CREB激活/抑制實(shí)驗(yàn) cAMP激動(dòng)劑Forskolin激活CREB的磷酸化，用PKA抑制劑H 89 2HCL抑制CREB的磷酸化，根據(jù)產(chǎn)家的操作指南和推薦濃度，用二甲基亞砜(DMSO)完全溶解Forskolin和H 89 2HCL，分別控制實(shí)驗(yàn)的終濃度Forskolin為35 μmol/L、H 89 2HCL 為30 μmol/L。用25 ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞至70%匯合度，棄除培養(yǎng)液，分別加入含H 89 2HCL(30 μmol/L)的培養(yǎng)液、單純培養(yǎng)液、含F(xiàn)orskolin(35 μmol/L)的培養(yǎng)液2 ml至不同組細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集細(xì)胞提取蛋白進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3Western印跡實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液于冰上裂解10 min，10 000 r/min、4℃離心30 min后取上清即為細(xì)胞總蛋白。二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白質(zhì)的濃度。取30 μg總蛋白于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠中電泳分離，之后轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉聚偏二氟乙烯(PVDF)膜2 h。1∶1 000稀釋的兔抗人CREB、p-CREB、PEN2、PS1-CTF、APP、GAPDH等抗體(均購自CST公司，美國)并于4℃孵育PVDF膜12 h，1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育2 h，采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1在Vector-SY5Y細(xì)胞中應(yīng)用CREB激動(dòng)劑和抑制劑之后有關(guān)蛋白水平比較 與對(duì)照組比較，激動(dòng)劑組中總CREB、APP的表達(dá)無明顯差異，p-CREB、PEN2、PS1-CTF的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；抑制劑組中總CREB、PEN2、PS1-CTF變化不明顯，APP的表達(dá)明顯上調(diào)，p-CREB明顯下調(diào)(P<0.05)，見表1、圖1。

2.2在Gaq-SY5Y細(xì)胞中應(yīng)用CREB激動(dòng)劑和抑制劑之后有關(guān)蛋白水平比較 與對(duì)照組比較，激動(dòng)劑組中總的CREB水平無明顯變化，p-CREB、PEN2表達(dá)量明顯上調(diào)，APP及PS1-CTF明顯下降(P<0.05)；抑制劑組中總的CREB、PS1-CTF水平均無明顯變化，p-CREB、PEN2、APP表達(dá)明顯下降(P<0.05)，見表1、圖2。

圖1 Vector-SY5Y細(xì)胞使用CREB抑制劑與激動(dòng)劑處理后有關(guān)蛋白表達(dá)

2.3在APP-SY5Y細(xì)胞中應(yīng)用CREB激動(dòng)劑和抑制劑之后有關(guān)蛋白水平比較 與對(duì)照組比較，激動(dòng)劑組中總CREB、APP變化不明顯，PS1-CTF表達(dá)明顯下降，p-CREB、PEN2表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；抑制劑組中總CREB表達(dá)量明顯增加，p-CREB變化不明顯，PEN2表達(dá)明顯下降，PS1-CTF、APP表達(dá)量明顯上升(P<0.05)，見表1、圖3。

圖2 Gaq-SY5Y細(xì)胞使用CREB抑制劑與激動(dòng)劑處理后有關(guān)蛋白表達(dá)

圖3 APP-SY5Y細(xì)胞使用CREB抑制劑與激動(dòng)劑處理后有關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

CREB在大腦所有細(xì)胞中都有表達(dá)，CREB參與學(xué)習(xí)和長期記憶的形成，是作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)家族中的一員。轉(zhuǎn)錄因子(如CREB)對(duì)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)起著至關(guān)重要的作用，其將發(fā)生在細(xì)胞膜上的事件傳遞至細(xì)胞核并引起基因表達(dá)的改變〔9〕。CREB轉(zhuǎn)錄因子家族的成員包括轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子(CREB 1)和抑制子(CREB 2)，并與許多信號(hào)蛋白相互作用，介導(dǎo)從短期記憶到長期記憶的轉(zhuǎn)變〔10〕。AD 是最常見的癡呆類型，占所有癡呆患者 60%～80%〔4〕。

Aβ的聚集和沉積不僅會(huì)破壞突觸結(jié)構(gòu)和功能，也會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致記憶和認(rèn)知功能障礙〔11〕。在AD模型Tg2576基因突變小鼠腦組織免疫組化分析顯示海馬和皮層CREB水平降低。轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中檢測(cè)到氧化應(yīng)激標(biāo)志物，顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞豐富的區(qū)域CREB染色減少〔12〕。在AD患者死后海馬標(biāo)本中，Aβ與CREB蛋白水平也呈負(fù)相關(guān)，由此可見CREB在AD中是減少的〔13〕。用福斯克林激活CREB(使其磷酸化)，可顯著促進(jìn)PEN2 的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)，而對(duì)γ-分泌酶復(fù)合物的其他組分沒有影響〔7〕。當(dāng)PS-1基因突變導(dǎo)致PS-1和PEN2聯(lián)系減少，Aβ42/Aβ40比例升高，但不影響γ分泌酶的功能和PS-1的內(nèi)分解，也不影響Notch信號(hào)通路，即當(dāng)PEN2表達(dá)量降低時(shí)Aβ42/Aβ40比例升高〔14〕。而在癡呆小鼠模型中使用γ分泌酶抑制劑，加重了小鼠的記憶障礙〔15〕。這也從側(cè)面說明了Aβ42可能在記憶形成中具有重要作用。

基于CREB在長期記憶形成中的重要作用及γ分泌酶復(fù)合體重要成分PS1、PEN2在Aβ生成和AD發(fā)生發(fā)展中的重要角色，且諸多文獻(xiàn)顯示CREB的改變?cè)贏D的發(fā)病中一直是作為記憶力變化的指標(biāo)，而CREB的減少到底是因還是果卻沒有具體的研究表明。本研究結(jié)果說明，CREB不僅可以作為記憶力變化的指標(biāo)，也可能是AD防治的重要靶點(diǎn)。Gαq蛋白是異源三聚體 G 蛋白 α 亞基中的一種，在大腦內(nèi)廣泛表達(dá)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在 SAMP8 早衰小鼠腦皮質(zhì)中，Gαq 隨著小鼠年齡的增長而減少〔16〕，這提示 Gαq 的表達(dá)水平與腦衰老相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SY5Y 細(xì)胞中過表達(dá) Gαq 發(fā)揮了明顯的抗氧化損傷作用〔17，18〕。本研究結(jié)果提示Gαq能與外源性CREB激活劑協(xié)同作用，從源頭上減少APP的生成。