益腎化濕顆粒調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路對糖尿病大鼠腎損傷的影響

劉翠蘭 王琳琳 楊文 劉圣君 曹艷春 潘星 劉華

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院 1腎內(nèi)科，河北 張家口 075000；2血液凈化科)

糖尿病屬于臨床常見慢性疾病，近年來發(fā)病率逐年升高，調(diào)查顯示發(fā)病率為9.7%，成為心腦血管、腫瘤后排名第3的威脅人類健康的疾病〔1〕。患者血糖長期處于高水平狀態(tài)，易造成微血管并發(fā)癥，如糖尿病腎病，而該病發(fā)病隱匿，病程持續(xù)時間較長，嚴重者最終發(fā)展為終末期腎衰竭，因此迫切探究其發(fā)病機制，對疾病的預防控制非常重要〔2〕。磷脂酰肌醇激酶-3(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路為糖尿病腎病中重要信號轉(zhuǎn)導途徑，該信號通路的過度激活能夠引發(fā)糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展〔3〕。10號染色體上缺失的磷酸酯酶和張力蛋白同源物基因(PTEN)可抑制PI3K/Akt信號通路活化，負性調(diào)控PI3K/Akt信號通路參與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展〔4〕。益腎化濕顆粒能夠利水消腫、益腎化濕的功效，臨床研究證實益腎化濕顆粒可緩解慢性腎盂腎炎患者尿急、尿痛等臨床癥狀〔5〕，然而益腎化濕顆粒具體作用機制尚不明確。本研究通過復制糖尿病腎損傷大鼠給予益腎化濕顆粒干預，觀察其對PI3K/Akt信號通路的影響，旨在探究腎化濕顆粒治療糖尿病腎病的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗藥物 益腎化濕顆粒主要成分為黃芪30 g，淫羊藿15 g，菟絲子12 g，巴戟天、白豆蔻、茯苓、薇香、石菖蒲、川芎、紅花、香附各10 g，蒼術(shù)、大腹皮各20 g，麻黃8 g；藥材均來自廣州康巨藥業(yè)有限公司，批號20170703。厄貝沙坦購于賽諾菲安萬特制藥公司，批號170412。

1.2實驗動物 SPF級SD大鼠，體重0.2～0.4 kg，8周齡，雄性，由河北北方學院實驗動物中心提供，合格證號SYXK(冀)2017-0001。所有大鼠在統(tǒng)一環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲用去離子水，室內(nèi)溫度控制在22～25℃，空氣相對濕度40%～60%，自由攝取食物，適性喂養(yǎng)1 w后用于模型制備。

1.3試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ，Amresco，美國，批號：170223)；血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號C013-2，C011-2)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、Tunel染色試劑盒、RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所，批號分別為C0105、C1086、P0013B)；戊二醛、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號DF0157，PC0020)；醋酸鈾(深圳卓越生物科技有限公司，批號541093)；檸檬酸鉛(金錦樂化學有限公司批號512265)；鼠抗PTEN、PI3K、p-Akt、Akt抗體(美國CST公司，批號9556，13666，12694，2920)；B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3、β-actin、辣根過氧化物酶(HRP)標記IgG抗體(美國Abcam公司，批號ab692，ab232479，ab179517，ab156302，ab205719)；E6型血糖儀(美國羅氏公司)；DxC全自動生化儀(國貝克曼庫爾特公司)；CKX53光學顯微鏡、IXTI-12FL/PH熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；SU8220透射電鏡(日本HITACHI公司)；1658001型垂直電泳儀、1703930轉(zhuǎn)膜儀、ChemiDoc XRS凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

1.4糖尿病腎損傷模型制備 大鼠在造模前采集尾靜脈血測定血糖濃度均符合4～6 mmol/L。隨機選取12只大鼠設(shè)定為正常組給予正常飼養(yǎng)喂養(yǎng)。其余78只大鼠用于造模，禁食不禁水12 h后，腹腔注射STZ-檸檬酸緩沖液，注射劑量為60 mg/kg，72 h后采集大鼠尾靜脈血檢測血糖，當空腹血糖(FBG)水平超過16.7 mmol/L，視為糖尿病模型制備成功〔6〕，正常組大鼠僅注射同體積的檸檬酸緩沖液。繼續(xù)喂養(yǎng)3 d后，收集大鼠24 h尿液，檢測尿蛋白量超過30 mg表明糖尿病腎損傷大鼠模型制備成功〔7〕，此過程中18只大鼠死亡，造模成功率為76.92%。

1.5動物給藥與分組 設(shè)置正常組，12只，將造模成功的60只大鼠分為糖尿病腎損傷組(模型組)、益腎化濕顆粒低、中、高劑量組，厄貝沙坦組(陽性對照)，每組均為12只。益腎化濕顆粒各組：造模后每日灌胃益腎化濕顆粒，參考文獻〔5〕，按照體表面積計算給藥劑量為9.3、18.5、37.0 g/kg；厄貝沙坦組：造模后每日給予厄貝沙坦水溶液，參考文獻〔7〕劑量選擇為0.02 g/kg；正常組、糖尿病腎損傷組造模后每日給予等量蒸餾水。各組大鼠均連續(xù)給藥8 w。

1.6樣本采集及指標檢測

1.6.1大鼠血清中FBG、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平測定 末次給藥結(jié)束后，采集所有大鼠尾靜脈血，采用血糖儀檢測FBG水平；利用全自動生化儀檢測TG、HDL-C、TC。

1.6.2BUN、Scr水平檢測 將血液置于離心機3 000 r/min離心5 min分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血清BUN、SCr水平，具體參考試劑盒說明書進行操作。

1.6.3大鼠24 h尿蛋白量檢測 采集所有大鼠24 h尿液，利用考馬斯亮藍法檢測24 h尿蛋白量。

1.6.4樣本采集 尾靜脈血采集后，測定大鼠體重，將大鼠麻醉處死后，獲取左側(cè)腎組織，測定重量；將腎臟組織平均切為兩部分，一部分于-80℃中凍存，一部分置于4%多聚甲醛中固定。

1.6.5腎臟病理形態(tài)學檢測 常規(guī)制備石蠟切片，脫蠟、水合后采用HE染色試劑盒對切片進行染色，置于顯微鏡下觀察腎臟組織形態(tài)學變化，采用Paller法〔8〕對腎小管損傷情況進行半定量評分，從腎小管是否出現(xiàn)細胞變性、擴張、壞死及細胞顆粒變性等方面進行評定。每個小鼠至少評價10個腎小管，均采用盲法評分。

1.6.6透射電鏡觀察腎臟組織超微結(jié)構(gòu) 取出腎臟組織清洗后用2.5%戊二醛4℃下固定2 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后添加丙酮室溫下放置20 min，經(jīng)環(huán)氧樹脂包埋后制備0.06 μm超薄切片，采用醋酸鈾-檸檬酸鉛染雙染色法對切片進行染色，置于透射電鏡下觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)變化。

1.6.7Tunel染色觀察腎組織細胞凋亡情況 參考Tunel染色試劑盒對腎組織切片染色，采用DAPI對細胞核染色，Tunel染色凋亡細胞，置于熒光光顯微鏡下觀察腎組織細胞凋亡情況，采用ImageproPlus 6.0軟件定量分析腎組織細胞凋亡率，細胞凋亡率(%)=凋亡細胞數(shù)量/細胞總數(shù)×100%。

1.6.8Western印跡檢測腎組織中PTEN、PI3K、p-Akt、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達 將腎組織研磨后加入RIPA裂解液，提取細胞總蛋白，用BCA法檢測總蛋白濃度，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后分離目的蛋白，轉(zhuǎn)膜后加入封閉液封閉蛋白后，用PTEN、PI3K、p-Akt、Bcl-2、Bax、caspase-3、β-actin一抗(1∶500)于4℃下孵育膜過夜，采用HRP標記IgG二抗室溫下孵育膜2 h，經(jīng)清洗、曝光、顯影后，于凝膠成像儀內(nèi)觀察保存蛋白圖片，用Imagepro Plus6.0軟件定量分析各蛋白表達情況。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組血糖、血脂水平比較 與正常組相比，其余各組FBG、TG、TC水平均顯著升高，HDL-C水平均顯著降低(P<0.05)。與糖尿病腎損傷組相比，益腎化濕顆粒各組、厄貝沙坦組FBG、TG、TC水平均顯著降低，HDL-C水平均顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.2各組尿代謝指標水平比較 與正常組相比，其余各組BUN、Scr、24 h尿蛋白量均顯著升高(P<0.05)。與糖尿病腎損傷組相比，益腎化濕顆粒各組、厄貝沙坦組BUN、Scr、24 h尿蛋白量均顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.3各組腎重、體重、腎重指數(shù)的影響 與正常組相比，其余各組腎重、腎重指數(shù)均顯著升高，體重顯著降低(P<0.05)。與糖尿病腎損傷組相比，益腎化濕顆粒各組、厄貝沙坦組腎重、腎重指數(shù)均顯著降低，體重顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.4益腎化濕顆粒對各組大鼠腎組織病理形態(tài)學的影響 HE染色顯示正常組腎小管、腎小球形態(tài)、結(jié)構(gòu)均正常，未發(fā)生炎性細胞浸潤；糖尿病腎損傷組腎小管發(fā)生腫脹、充血，腎組織細胞變性、腫脹，空泡變形，部分上皮細胞脫落，腎小球基底膜增厚，腎組織出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤。與糖尿病腎損傷組相比，給藥組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)均得到一定改善，其中益腎化濕顆粒高劑量組、厄貝沙坦組改善較明顯。與正常組〔(0.14±0.03)分〕相比，糖尿病腎損傷大鼠腎組織損傷評分顯著升高〔糖尿病腎損傷組(3.18±0.16)分、益腎化濕顆粒低劑量組(2.42±0.18)分、益腎化濕顆粒中劑量組(2.08±0.19)分、益腎化濕顆粒高劑量組(1.36±0.22)分、厄貝沙坦組(1.27±0.24)分，P<0.05〕。與糖尿病腎損傷組相比，益腎化濕顆粒各組、厄貝沙坦組腎組織損傷評分顯著降低(P<0.05)。見圖1。

1～6：正常組、糖尿病腎損傷組、益腎化濕顆粒低劑量組、益腎化濕顆粒中劑量組、益腎化濕顆粒高劑量組、厄貝沙坦組；下圖同圖1 HE染色觀察腎組織病理形態(tài)學變化(×200)

2.5益腎化濕顆粒對大鼠腎小球超微結(jié)構(gòu)的影響 與正常組相比，糖尿病腎損傷組腎小管上皮細胞質(zhì)發(fā)生溶解，胞膜內(nèi)褶皺斷裂，腎小球血管內(nèi)皮腫脹，基膜不均勻，且部分足突出現(xiàn)融合；給藥各組腎小管上皮細胞形態(tài)得到一定改善，腎小球內(nèi)皮腫脹程度減輕，益腎化濕顆粒高劑量組、厄貝沙坦組改善較明顯。見圖2。

圖2 透射電鏡觀察大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)(×15 000)

2.6各組腎組織PI3K/Akt信號通路蛋白表達水平比較 與正常組相比，其余各組大鼠腎組織PTEN蛋白表達顯著降低，PI3K蛋白表達及p-Akt/Akt磷酸化水平顯著升高(P<0.05)；與糖尿病腎損傷組相比，益腎化濕顆粒各組、厄貝沙坦組腎組織PTEN蛋白表達顯著升高，PI3K蛋白表達及p-Akt/Akt水平顯著降低(P<0.05)。見表3、圖3。

圖3 Western印跡檢測腎組織中PTEN、PI3K、p-Akt蛋白表達情況

2.7益腎化濕顆粒對大鼠腎組織細胞凋亡的影響 與正常組〔(8.48±0.76)%〕相比，糖尿病腎損傷大鼠腎組織細胞凋亡率顯著升高〔糖尿病腎損傷組(35.76±2.39)%、益腎化顆粒低劑量組(26.42±2.83)%、中劑量組(22.76±1.26)%、高劑量組(19.44±1.93)%、厄貝沙坦組(14.13±1.15)%，P<0.05〕；與糖尿病腎損傷組相比，益腎化濕顆粒各組、厄貝沙坦組腎組織細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖4。

2.8益腎化濕顆粒對大鼠腎組織Bcl-2、Bax、caspase-3凋亡蛋白表達的影響 與正常組相比，其余各組大鼠腎組織Bcl-2蛋白表達顯著降低，Bax、caspase-3蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與糖尿病腎損傷組相比，益腎化濕顆粒各組、厄貝沙坦組腎組織Bcl-2蛋白表達顯著升高，Bax、caspase-3蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表3、圖5。

圖4 Tunel染色觀察腎組織細胞凋亡情況(100×)

圖5 Western印跡檢測腎組織中Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達

3 討 論

糖尿病腎病主要為機體在糖代謝過程中血糖水平過高導致的腎小球硬化，患者一般表現(xiàn)為血尿、蛋白尿等腎功能損傷，病理表現(xiàn)為腎小球基底膜損傷，腎組織上皮細胞變性及腎小管損傷，晚期則會出現(xiàn)腎功能衰竭，這是造成糖尿病患者死亡的重要原因之一。本研究結(jié)果說明大鼠出現(xiàn)腎水腫及腎功能受損。組織學檢測及電鏡檢測發(fā)現(xiàn)腎小管發(fā)生腫脹、充血等損傷，腎小管上皮細胞質(zhì)發(fā)生溶解，胞膜內(nèi)褶皺斷裂，腎小球血管內(nèi)皮腫脹，基膜不均勻，且部分足突出現(xiàn)融合，進一步證實糖尿病大鼠發(fā)生腎損傷，與過往糖尿病腎損傷動物模型制備結(jié)果相似〔9〕，提示糖尿病腎損傷大鼠造模成功。

中醫(yī)認為糖尿病腎病主要特征為本虛標實，患者脾腎衰敗，同時體內(nèi)伴有血瘀、濕濁，造成濁邪擁滯，內(nèi)蘊為毒，因此活血排毒、消水利腫、益脾健腎是治療的主要目的〔10〕。益腎化濕顆粒主要由黃芪、淫羊藿、菟絲子、巴戟天、白豆蔻、茯苓等組成，菟絲子具有益精血、補腎的功效,黃芪具有升陽補脾的功效,淫羊藿、巴戟天祛濕、補腎助陽的功效,白豆蔻具有溫中益氣化濕,蒼術(shù)燥濕健脾,茯苓具有化濕利水、燥脾去濕功效,大腹皮可利水消腫,藿香、石菖蒲芳香化濕,麻黃宣肺利水,紅花、川芎具有活血化瘀，香附可疏肝理氣〔11,12〕。整方具有益腎化濕、利水消腫、升陽補脾的效果。本研究結(jié)果提示益腎化濕顆粒可減輕糖尿病大鼠腎水腫，緩解腎組織損傷，進而發(fā)揮對糖尿病大鼠的腎臟保護作用。

PIK3/Akt信號通路是膜受體信號向胞內(nèi)傳遞的重要途徑，在細胞增殖、分化、凋亡中發(fā)揮重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)PIK3/Akt信號通路過度激活與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔13〕。PTEN可作為PIK3/Akt信號通路上游負調(diào)節(jié)因子，參與糖尿病腎病的發(fā)生〔14〕。研究顯示PTEN能夠使PI3K底物失活進而降低PI3K的水平，阻礙信號的傳遞抑制下游Akt發(fā)生磷酸化，進而參與各種疾病的發(fā)生〔15〕。Huang等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)PIK3/Akt信號通路活化后能夠介導足細胞損傷。Lu 等〔17〕發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白表達降低后可造成TGF-β1過度激活PIK3/Akt信號通路，進而促進腎小管上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化。本研究提示PTEN負調(diào)控的PIK3/Akt信號通路活化可能參與糖尿病腎損傷的發(fā)生。經(jīng)益腎化濕顆粒干預后，腎組織中PTEN表達升高低，PI3K蛋白以及Akt磷酸化水平降低，益腎化濕顆粒能夠通過抑制PIK3/Akt信號通路的活化，緩解腎組織損傷，改善腎臟功能。

凋亡是糖尿病腎病的重要發(fā)病機制之一，腎臟組織細胞的凋亡可能為腎小球硬化過程中細胞數(shù)量減少的重要原因〔18〕。caspase-3是細胞凋亡過程中最重要的蛋白酶，是多種凋亡途徑的共同下游效應部分，在細胞凋亡的啟動和執(zhí)行過程中起重要作用〔19〕。據(jù)報道，PIK3/Akt激活后使磷酸化后的Akt能夠作用于下游的Bcl-2、caspase-3等多個靶點，介導細胞的增殖、凋亡〔20〕。本研究提示益腎化濕顆粒具有腎組織保護作用，在腎損傷中具有抗凋亡作用，且這一作用與PIK3/Akt/caspase-3信號級聯(lián)相關(guān)。

綜上，益腎化濕顆粒能夠通過抑制PIK3/Akt信號通路活化，降低糖尿病大鼠腎損傷、減少腎組織細胞凋亡，從而誘導腎組織修復及腎功能恢復。益腎化濕顆粒的這一新發(fā)現(xiàn)可能為糖尿病腎病的治療提供新的參考。本研究也存在一定的不足，益腎化濕顆粒僅能緩解糖尿病引發(fā)的腎損傷，然而不能完全逆轉(zhuǎn)，這可能與益腎化濕顆粒其他作用途徑有關(guān)，具體機制還有待后續(xù)深入研究。