碳基量子點在病毒檢測及抗病毒領域的研究進展

童婷，梁建功

華中農業大學資源與環境學院/理學院，武漢 430070

量子點是一類尺寸小于激子玻爾半徑的半導體納米晶體，其電子在三維方向被限制在束縛態和離散態之間，因其具有寬的激發光譜、窄而對稱的發射光譜、高的熒光量子產率、可調諧的顏色等特點，已經成為體內成像和診斷治療等多個領域的研究熱點[1-4]。然而，很多量子點都是由重金屬離子(例如，Cd2+)制成的，這可能導致潛在的體外毒性，阻礙其實際應用[5-6]。碳基量子點(CQDs)，包括球形碳點和石墨烯量子點，作為一類新興的具有良好生物相容性和獨特光致發光性的材料應運而生[7-8]。碳點包括碳量子點、碳納米點、碳聚合物點等，一般尺寸小于10 nm，具有熒光發射特性及量子尺寸效應[9-11]；石墨烯量子點是指片層尺寸在100 nm范圍內，片層層數在10層以下的具有熒光發射及量子尺寸效應的納米材料[12]。目前，碳基量子點已經成為光催化、生物成像、納米藥物等領域的研究熱點[13]。近年來研究發現，碳基量子點還可用于高靈敏的病毒檢測新方法及高效抗病毒治療藥物[14-15]。本文在簡要介紹碳基量子點的合成方法及光學性質的基礎上，系統總結了碳基量子點在病毒檢測及抗病毒領域的研究進展，以期為量子點在病毒檢測及抗病毒領域的進一步應用提供參考。

1 碳基量子點的合成方法

根據碳源的不同，碳基量子點的合成方法可分為自上而下法及自下而上法兩大類，前一類方法主要通過剝離或切割一些大尺寸的碳材料來獲得小尺寸的碳點，采用石墨片、石墨粉及碳纖維等為碳前驅體，利用電弧放電法、高能激光法、熱裂解法、電化學法、化學氧化法等具體制備；后一類方法主要利用有機小分子或低聚物為原料，通過聚集的方式來合成納米尺寸的碳點，具體方法包括水熱/溶劑熱法、模板支撐法、反向膠束法等。下面對每一種方法分別舉例介紹。

1.1 電弧放電法

2004年，Xu等[16]在凈化由電弧放電煙塵產生的單壁碳納米管的過程中發現了碳點，他們首先用3.3 mol/L HNO3氧化電弧煙塵，引入羧基官能團，提高材料的親水性。然后用NaOH溶液(pH 8.4)提取沉積物，得到穩定的黑色懸浮液。這種懸浮液通過凝膠電泳后分離成3個電泳帶，在366 nm激發下，按洗脫尺寸的順序分別發射綠藍色、黃色和橙色的熒光。

1.2 激光燒蝕法

2006年，Sun等[17]開創性地引入了激光燒蝕技術制備碳點，將碳點的概念進一步推廣使碳點猛然成為研究熱潮。在載氣水蒸氣和氬氣的存在下，暴露熱壓石墨粉末和水泥制成的碳靶，通過激光燒蝕技術產生了碳點。

1.3 化學氧化法

化學氧化法通常采用濃酸等強氧化劑，為處理多種碳前驅體提供氧化環境，有趣的是，用這種方法合成的來自不同前驅體的碳點具有相似的尺寸分布、組成、光學性質和表面性質。Tao等[18]利用不同的碳前驅體，如單壁碳納米管、多壁碳納米管和石墨，硫酸和硝酸作為氧化劑，通過這種方法制備了具有較低的細胞毒性的碳點。

1.4 水熱合成法

水熱合成是制備碳點最簡單、經濟、廣泛的路線之一。該方法具有使用的儀器便宜、能耗低、合成參數易于調節等優點。2010年，Pan等[19]采用水熱法切割石墨烯片獲得了藍色發光的石墨烯量子點。2015年，Xu等[20]采用水熱合成路線，從檸檬酸鈉和硫代硫酸鈉中制備了摻硫碳點。通過優化前驅體的配比、溫度和反應時間，得到了平均大小為4.6 nm、分布均勻、量子產率達67% 的熒光性能良好的碳點。傅里葉變換紅外光譜揭示其表面大量的羥基賦予了該碳點良好的水溶性。

生活中常見的生物質如：核桃皮、大蒜、木瓜汁、稻殼、冬瓜、荔枝種子、鵝毛、蠶、蜂花粉、牛奶、甜椒、柚皮、香菜葉等都已經被用來大規模合成碳點，這里不再贅述[21]。微波輔助水熱合成法、超聲輔助水熱合成法由于反應速度快、尺寸均一，合成條件簡單等特點，目前應用較為廣泛[22]。

1.5 熱裂解法

高溫下導致前驅體碳化的熱裂解法也已被廣泛報道用于制備碳點，通常碳前驅體經歷了脫水、聚合、碳化等過程。Chandra等[23]開發了一種固相熱解路線來制備氮磷共摻雜的碳點。檸檬酸(碳源)與磷酸氫二銨(氮和磷源)以物質的量之比1∶4的比例研磨。然后置于硅坩堝中，在180 ℃下加熱1 h。隨后，對碳化的前驅體用去離子水溶解并純化得到可用于檢測Fe3+的碳點。

1.6 模板法

模板法也被用于合成具有受控形貌和特定性能的碳點。該合成路線一般包括2個步驟：(1)在模板中煅燒以合成碳點；(2)刻蝕模板以去除載體并釋放碳點。Liu等[24]以類兩性共聚物F127修飾的二氧化硅膠體球為載體，以甲酚為碳前驅體的衛星狀聚合物/F127/二氧化硅復合材料，對復合材料進行高溫處理和刻蝕以產生納米尺寸的碳點。進一步的酸處理和表面鈍化導致水溶性和多色發射，熒光量子產率為14.7%。

1.7 電化學合成法

在典型的電化學合成裝置中，采用3個電極：碳前驅體作為工作電極，其余2個電極作為對電極和參比電極。使用不同的碳前驅體，并調整實驗裝置，通過外加電壓和電解質嵌入的共同作用，可獲得不同性能的從碳前驅體表面剝離的碳點。Bao等[25]以碳纖維為工作電極，鉑和銀絲分別為對電極和準參比電極，合成了具有較窄的尺寸分布、無需進一步分離純化的碳點。

1.8 反向膠束法

Kwona等[26]開發了反向膠束法制備碳點，簡單地說，在雙(2-乙基己基)琥珀酸鈉鹽作為表面活性劑的輔助下，將葡萄糖水溶液與癸混合，形成水油反膠束。加熱至160 ℃后，葡萄糖分子發生縮合聚合形成低聚糖。由于水分蒸發，膠束會達到臨界過飽和點，導致低聚糖同時碳化和原位鈍化。通過操縱膠束內的水/表面活性劑物質的量之比，可以控制碳點的直徑。

2 碳基量子點的光學性質

碳基量子點不僅存在sp2及sp3雜化結構的碳原子，還存在C=C雙鍵、C=O雙鍵等官能團，其吸收光譜和熒光發射光譜會受到共軛π電子結構、表面修飾等多種因素的影響[27]。

2.1 碳點的發光機制

碳點的吸收峰一般在230～340 nm，其中230～280 nm處的吸收峰主要是由C=C雙鍵的π-π*躍遷引起的，其在300～340 nm處的肩峰主要是由C=O雙鍵的n-π*躍遷引起的[28]。碳點的熒光發射波長可在藍色到紅色范圍內進行調控，主要受到尺寸及表面基團的影響，研究者先后提出了量子限域效應及表面缺陷模型解釋碳點的發光機制，確切的熒光發射機制還有待進一步研究[29]。

根據組成的不同，塊體材料的帶隙能量被定義為激發電子從基態到空位導帶所需的最小能量，當吸收大于帶隙能量時，電子被激發到導帶中，產生由電子空穴對組成的激子，隨后，這些激子伴隨光子的發射而湮滅。激子在納米范圍內具有有限的尺寸，稱為玻爾激子半徑。當粒子尺寸小于激子時，它們的電荷載流子在空間上被限制在粒子內，導致光致發光的現象。碳基量子點尺寸小于其激子玻爾半徑，因此發生量子限域效應，而sp3碳基體中存在的孤立的sp2團簇會導致電子空穴對的局域化和小團簇的輻射復合，從而導致碳點激發依賴的光致發光性質[30-31]。

碳點發光的另一種機制可用表面缺陷模型來解釋。在碳點合成及后修飾過程中，由于其表面官能團具有不同的能級，從而形成了具有不同發射特征的表面缺陷。當激發光波長不同時，所激發的碳點表面具有發射特征的能量缺陷也不相同，這就導致碳點產生了激發依賴的熒光發射行為。如果碳點表面狀態是均勻的或完全鈍化的，其最大熒光發射波長則與激發光波長無關[31]。

2.2 石墨烯量子點的發光機制

石墨烯量子點是一類小的石墨烯碎片，不僅保持了二維石墨烯獨特的物理化學性質，同時具有量子點的發光特性[32]。石墨烯量子點中存在碳碳雙鍵，在230 nm處有一個強的吸收信號，主要由于C=C雙鍵的π-π*躍遷引起的，其在270～390 nm有1個肩峰吸收信號，是由C=O雙鍵的n-π*躍遷引起的[33]。石墨烯量子點具有尺寸依賴熒光發射的特性，其熒光發射會隨著尺寸、pH、溶劑的不同而發生改變。目前，研究者提出了共軛π域模型、邊態模型及表面態模型解釋石墨烯量子點的熒光發射機制[34]。

共軛π域模型是指石墨烯量子點中sp2和sp3鍵合物的電子被限制在其共軛π域內。而光電性能是由sp2位點的π狀態決定的，sp2團簇的π和π*電子能級位于sp3矩陣的σ和σ*態禁帶之間，從最低未占據分子軌道(LUMO)到最高占據分子軌道(HOMO)的轉變。HOMO-LUMO的帶隙取決于石墨烯量子點的大小，并且隨著石墨烯量子點的增大而減小。由于電子空穴對的復合，這些sp2結構域充當發光中心。帶隙受sp2域的比例、大小和形狀的影響[33-34]。

邊態模型是闡明石墨烯量子點光致發光的另一個著名模型。Zhu等[35]研究了4種石墨烯量子點(C42H18、C96H30、 C132H34、 C222H42)的光致發光機制，揭示了本征狀態取決于尺寸，而本征狀態和邊緣狀態之間的能級偏移決定了它們的光學性質。Pan等[19]認為石墨烯量子點的藍色發光可能來源于具有卡賓樣三重態的自由鋸齒形位點，稱為σ1π1，這導致了酸性和堿性條件下光致發光強度的不同。

表面態模型指石墨烯量子點表面的氧相關基團、官能團和表面缺陷會影響其光致發光性能。Jin等[36]觀察到與未功能化的石墨烯量子點相比，胺功能化石墨烯量子點表現出紅移，胺功能化石墨烯量子點的光致發光發射也通過改變官能團的質子化或去質子化而轉移，試驗數據和密度泛函理論計算表明，官能團與石墨烯量子點之間的電荷轉移可以調節石墨烯量子點的帶隙，石墨烯量子點中電子密度的變化導致光致發光。

3 碳基量子點在病毒檢測中的應用

病毒檢測包括血清學檢測及病原學檢測兩大類，血清學檢測主要是檢測血液中病毒感染產生的抗體，病原學檢測主要檢測病毒感染產生的核酸、蛋白或病毒粒子[37]。碳點及石墨烯量子點具有良好的發光性質及電化學性質，易通過熒光共振能量轉移，光誘導電子轉移導致的熒光變化來構建快速、高靈敏的病毒檢測新方法。

3.1 碳點在病毒檢測中的應用

利用碳點熒光信號的改變，已經成功建立了發熱伴血小板減少綜合征病毒、人T淋巴細胞白血病病毒及HIV病毒的快速檢測新方法[38-41]。發熱伴血小板減少綜合征病毒是一種分節段負鏈RNA病毒，病毒顆粒80～100 nm，該病毒已被世界衛生組織列為引起嚴重發熱的最危險病原體[38]。Xu 等[39]將發熱伴血小板減少綜合征(SFTSV)抗體偶聯到碳點/二氧化硅納米微球表面，基于碳點的熒光信號，結合側向層析檢測技術，建立了SFTSV核蛋白檢測新方法，檢出限為10 pg/mL。人T淋巴細胞白血病病毒-1(HTLV-1)是一種逆轉錄病毒，該病毒不僅能夠導致成人T細胞白血病/淋巴瘤，而且會導致熱帶痙攣性下肢癱瘓。Zarei-Ghobadi等[40]將特定序列單鏈DNA與碳點偶聯，并將碳點與四氧化三鐵/金復合材料混合，發現四氧化三鐵/金可猝滅碳點的熒光信號，當體系中存在互補的DNA序列時，由于形成了雙鏈DNA，使得碳點遠離四氧化三鐵/金復合納米材料，熒光得以恢復。基于這一原理，他們建立了HTLV-1核酸片段檢測新方法，檢出限達10 nmol/L。Qaddare等[41]將特定序列的單鏈DNA偶聯到碳點表面，當體系中存在金/石墨烯復合納米材料時，由于熒光共振能量轉移的存在，碳點的熒光被猝滅，當向該體系中進一步加入互補序列的靶基因時，由于體系中形成雙鏈DNA，導致碳點與金/石墨烯復合納米材料之間距離變大，使得碳點的熒光信號恢復，基于這一原理，他們構建了HIV-1基因傳感器，該傳感器檢出限可達15 fmol/L。

3.2 石墨烯量子點在病毒檢測中的應用

基于石墨烯量子點熒光增強或猝滅所建立的病毒檢測方法，已經成功用于腺病毒、HIV病毒、肝炎病毒及登革熱病毒等的檢測[42-45]。Ahmed等[42]將雞腺病毒抗體分別與金納米束及石墨烯量子點偶聯，當體系中存在雞腺病毒時，由于抗體與抗原之間特異的相互作用，金納米束及石墨烯量子點就會結合到雞腺病毒表面，其在紫外燈照射下，會產生局部電信號增強。基于這一原理，該研究建立了雞腺病毒高靈敏檢測新方法，該方法檢出限為8.75 pfu/mL，比傳統的ELISA方法靈敏度提高了100倍。Xiang等[43]將石墨烯量子點修飾到玻碳電極表面，基于DNA雜交前后峰電流的變化，建立了乙肝病毒DNA片段快速、高靈敏檢測新方法，該方法線性范圍為10～500 nmol/L，檢出限為1 nmol/L。Li等[44]研究發現，由于熒光共振能量轉移的存在，偶聯猝滅劑(BHQ2)的單鏈DNA可猝滅B，N共摻雜石墨烯量子點的熒光信號，當體系中有互補序列DNA存在時，由于雙鏈DNA的形成，導致猝滅劑遠離石墨烯量子點，熒光信號得到恢復。基于這一原理，他們建立了HIV病毒DNA的快速檢測方法，并將所建立的方法用于HIV病毒DNA進入細胞的動態檢測。Ghanbari等[45]將石墨烯量子點及核酸適配體修飾到玻碳電極表面，當向體系中加入丙肝病毒核心抗原后，體系的電化學阻抗譜會發生明顯的改變，基于這一原理，他們建立了丙肝病毒核心抗原快速、高靈敏檢測新方法，該方法檢出限為3.3 pg/mL，他們進一步將所建立的方法用于人血清中丙肝病毒核心抗原的檢測，取得了很好的效果。Valipour等[46]將銀納米粒子、帶有巰基的石墨烯量子點及抗體修飾到玻碳電極表面，基于加入丙肝病毒核心抗原前后電化學信號的變化，利用微分脈沖伏安法對丙肝病毒核心抗原進行了快速高靈敏檢測，檢出限達3 fg/mL。Chowdhury等[47]利用末端帶有巰基的單鏈DNA修飾到N，S共摻雜石墨烯量子點及金納米粒子復合材料表面，利用4種有機熒光染料修飾的DNA探針，建立了登革熱病毒亞型的熒光及電化學檢測新方法，檢出限低到9.4 fmol/L。

4 碳基量子點抗病毒研究進展

碳基量子點在抗病毒領域也具有良好的應用前景。研究表明，碳基量子點對DNA病毒及RNA病毒均具有良好的抗病毒效果[14-15]，本部分就該領域的研究進展進行系統闡述。

4.1 碳點在抗病毒領域應用研究進展

早在2016年，研究者就發現了碳點對病毒增殖具有良好的抑制作用。Barras等[48]研究發現，以4-氨基苯基硼酸鹽為主要原料合成的碳點對Ⅰ型皰疹病毒(HSV-1)具有良好的抑制效果，其EC50值低至80 ng/mL，他們認為碳點在阻止病毒進入細胞的過程中發揮著關鍵的作用。Du等[49]研究發現，聚乙二醇二胺及抗壞血酸來源的碳點，可以通過誘導α干擾素的方式，抑制豬偽狂犬病毒(PRV)及豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)增殖。Fahmi等[50]研究發現，硼酸修飾的碳點可以與病毒表面gp120蛋白結合，抑制合胞體的形成，從而阻止Ⅰ型艾滋病病毒(HIV-1)進入細胞。Aung等[51]最近再次證實了氨基苯硼酸修飾的碳點對HIV-1增殖的抑制效果，并且該碳點表現出極低的細胞毒性(CC50值11.2 mg/mL)。

研究者們發現，采用不同原料合成的碳點對腸道病毒EV71、日本腦炎病毒及人冠狀病毒等均具有良好的抗病毒作用。例如：Huang等[52]制備了一種苯并惡嗪單體衍生碳點，并證明了它們對黃病毒(日本腦炎、寨卡病毒和登革熱病毒)和非包膜病毒(豬細小病毒和腺病毒相關病毒)的感染阻斷能力。Lin等[53]發現，以姜黃素為原料合成的碳點(CCM-CDs)，對腸道病毒EV71抑制的EC50值低至0.2 μg/mL，活體實驗表明，CCM-CDs可顯著降低腸道病毒EV71感染小鼠的死亡率。Du等[54]也發現CCM-CDs處理可以改變冠狀病毒豬流行性腹瀉病毒(PEDV)表面蛋白的結構，抑制病毒負鏈RNA的合成等機制抑制PEDV的增殖。筆者所在課題組與肖少波教授課題組合作，采用大麥若葉與尿素為原料，合成了藍色發光及青色發光的碳點，進一步研究表明，2種碳點均可通過誘導干擾素的產生抑制PRV增殖[55]；在此基礎上，2個課題組合作，以甘草酸為原料，合成了具有高抗病毒效果的甘草酸碳點，研究發現，甘草酸碳點對PRRSV、PRV及PEDV均具有良好的抑制作用，該碳點不僅可與病毒多靶點結合從而抑制病毒的入侵過程，還可通過刺激細胞天然免疫信號通路、抑制活性氧、調控細胞內宿主限制因子等途徑抑制病毒的復制過程，其對病毒的最大抑制效果可達5個滴度以上[56]。白斑綜合征病毒(WSSV)是一種雙鏈環狀DNA病毒，該病毒給養蝦業造成了嚴重的經濟損失。Huang等[57]研究發現，多胺修飾的碳點不僅可吸附在WSSV的包膜上，抑制病毒的增殖，而且可通過上調對蝦的免疫基因，降低因WSSV感染的蝦的死亡率。Dong等[58]發現表面修飾2,2′-(亞乙基二氧基)雙(乙胺)和3-乙氧基丙胺的碳點可抑制諾如病毒病毒樣顆粒與人細胞組織血型抗原(HBGA)受體的結合，表明該碳點對諾如病毒具有潛在的抗病毒活性。

Ju等[59]報道了碳基量子點介導的鎖定核酸抑制因子對病毒miRNAs的特異性抑制作用從而抑制了致癌病毒卡波西肉瘤相關皰疹病毒(KSHV)相關原發性積液淋巴瘤細胞的增殖。隨著新冠病毒的流行，冠狀病毒的治療也引起了研究者的廣泛關注。oczechin等[60]研究發現，采用硼酸修飾乙二酸檸檬酸碳點對人類冠狀病毒HCoV有抑制效果，EC50值為(5.2 ± 0.7) μg/mL，證實了碳點在冠狀病毒的治療中具有潛在的應用價值。

4.2 石墨烯量子點在抗病毒領域研究進展

作為新一代納米熒光材料，石墨烯量子點在抗病毒領域具有良好的應用前景[61]。Iannazzo等[62]將2種逆轉錄酶抑制劑(CHI499及CDF119)與石墨烯量子點偶聯，研究了復合材料對HIV-1增殖的影響，結果表明，偶聯CHI499的石墨烯量子點結合了CHI499和石墨烯量子點的雙重優勢，對HIV-1具有良好的抑制效果，IC50值低達0.09 μg/mL，是一種很好的用于HIV治療的潛在候選藥物。

5 展 望

由于病毒種類很多，不同病毒感染機制差異很大。發展新型碳基量子點的高靈敏病毒檢測方法將是該領域未來的一個研究熱點。如何改變碳基量子點的合成原料及表面修飾，使其能夠對多種病毒產生抗病毒效果，也是今后需要進一步解決的關鍵問題之一。另外，由于碳基量子點還可作為納米載體將藥物導入細胞及組織，未來該材料還可用于高效納米疫苗的研發。當前，由SARS-CoV-2病毒感染的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)正在全球流行，截至2020年12月12日，該病已經造成全球接近7 000萬人感染，超過157萬人死亡[63]。碳基量子點作為一種新型抗病毒材料，未來有望在SARS-CoV-2病毒的診斷及治療過程中發揮重要的作用。