偽狂犬病病毒US3基因編碼絲/蘇氨酸蛋白激酶功能的研究進展

郭仕琦，許夢微，王志勝，何青，王繼春，張傳健*

(1. 江蘇省農業科學院動物免疫工程研究所，江蘇 南京 210014；2. 南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095；3. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州 225009；4. 常州同泰生物藥業科技有限公司，江蘇 常州 213136)

偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)屬于皰疹病毒科α皰疹病毒亞科水痘病毒屬,是一種雙鏈DNA病毒，大小約為150 kb[1]。偽狂犬病由PRV感染多種家畜和野生動物引起，是一種急性、可垂直傳播的傳染病，臨床癥狀主要表現為發熱、奇癢(除豬外)、腦脊髓炎[2-3]。豬是PRV的主要自然宿主，成年豬群感染后表現為隱性感染和生殖系統癥狀，妊娠母豬發生流產、產死胎、木乃伊胎等，公豬則表現為睪丸炎，仔豬表現為發熱、神經癥狀以及高死亡率，給養豬業帶來巨大的經濟損失，是危害全球養豬業的主要傳染病之一[4-5]。2011年以來，一種PRV變異株在我國豬群中暴發，研究發現其致病力顯著增強，甚至引起成年豬死亡[6]。應用變異株同源病毒研發的基因缺失疫苗(缺失gE/gI、gE/TK、gI/TK等)雖可提供有效保護力[7-9]，但對新生仔豬的安全性還存在隱患[8]，說明存在其他毒力基因的病毒毒力。

US3基因是PRV的重要毒力基因，其開放閱讀框長度為1 002～1 170 bp，編碼334～390個氨基酸的蛋白絲/蘇氨酸激酶，該蛋白在α皰疹病毒中高度保守[10]，具有磷酸化的活性，通過磷酸化發揮相應的功能[11]。PRV US3基因編碼蛋白為多功能蛋白，可以分為兩個亞型(US3a、US3b)，它們的大小、豐度和細胞內定位不同。較大亞型US3a的分子量為53 kDa，US3b分子量為41 kDa。由于US3基因編碼蛋白分子較大，超過了被動擴散的限制，所以US3主要通過主動運輸穿梭于細胞核質之間。在感染細胞中主要以US3b的形式存在。相較于US3b，US3a在其N-末端有額外的51個氨基酸。在US3a感染細胞中，US3a主要位于線粒體中，可分布在核膜和質膜之中。近年來研究發現，US3基因編碼蛋白在病毒的擴散和侵入過程中起重要作用，此外還參與PRV逃避宿主免疫清除、抑制病毒引起的細胞凋亡，促病毒粒子出細胞核，調動感染細胞肌動蛋白骨架重排，誘導宿主細胞形態改變進而增強PRV在細胞中的感染能力。本文對US3基因編碼蛋白在感染細胞中發揮的作用進行了綜述。

1 US3影響病毒毒力

宿主的神經系統是PRV復制的主要靶點，通過研究PRV感染宿主中神經細胞的變化可解析病毒對神經系統的侵害。Olsen等[12]通過隔離培養體系，探究US3編碼蛋白對PRV在神經元中的復制以及對嚙齒動物毒力的影響。研究發現，US3突變株在神經元中的毒力較野生毒株減少了約10倍。此外，US3突變株接種大鼠臨床表現癥狀為遲發型，隨著時間的推移癥狀不斷加重，最終接近野生毒株感染癥狀。

本研究團隊近來研究發現，US3基因失活株相較于親本毒株(LD50=10-3.26/0.2 mL)，US3基因失活株攻毒小鼠全部存活(初始滴度均為106TCID50/mL的親本毒株和US3基因失活株，10倍系列稀釋至10-5，取10-2～10-5進行攻毒)，表明US3基因失活可降低PRV對小鼠的致病性[13]。Kimman等[14]研究了PRV US3缺失株對豬的致病性，發現US3缺失致使PRV對豬的致病性降低。接種缺失株的10周齡生長豬相較于親本毒株組，發熱期縮短，排毒量減少；相較于陰性對照組，體重無顯著差異。接種缺失株的3周齡仔豬僅出現2～4 d發熱期，相較于陰性對照組，食欲和體重無顯著差異。以上研究表明，US3在病毒感染宿主的過程中起重要作用，其突變會造成病毒毒力下降，進而導致病毒對宿主致病力減弱，這為PRV基因工程活疫苗的開發提供新的缺失靶點。

2 US3引起宿主免疫抑制

PRV可在豬體形成潛伏感染，引起免疫抑制，從而減少被清除概率，增加復制和傳播機率[15]。自然殺傷(natural killer，NK)細胞可清除體內異常細胞，是一種宿主細胞自我保護的正常反應。CD300a是一種高度保守的抑制性NK細胞受體，可識別細胞表面暴露的氨基磷脂，如磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺，通過與配體的相互作用，抑制NK細胞的溶解活性。Grauwet等[16]研究表明，PRV US3能夠激發CD300a受體與感染細胞表面的氨基磷脂結合，從而阻止感染細胞被NK細胞裂解。近來研究發現，US3通過降解Bcl-2相關轉錄因子1抑制Ⅰ型IFN反應，這在一定程度上促進PRV形成持續性感染[17]。

此外，許多皰疹病毒可通過干擾主要組織相容性復合物Ⅰ(major histocompatibility complex，MHC-Ⅰ)介導的抗原遞呈途徑，避免或延遲CD8+ T細胞的清除作用，進而引起免疫抑制。Deruelle等[18]發現，PRV US3介導細胞表面MHC-Ⅰ下調機制呈細胞依賴性。US3可影響ST細胞表面MHC-Ⅰ表達，但是在PK-15和豬肺泡巨噬細胞中，US3對MHC-Ⅰ表達無顯著影響。進一步研究發現，PRV感染ST細胞過程中，US3介導細胞表面MHC-Ⅰ的下調，取決于US3基因編碼的激酶活性，用US3構建的真核表達質粒，對ST細胞表面MHC-Ⅰ的表達無顯著影響。可能由于US3磷酸化的其他病毒蛋白參與，降低了PRV感染ST細胞表面MHC-Ⅰ的表達，因此，解析US3在ST細胞中介導的MHC-Ⅰ下調的機制具有重要意義。

此外，參與MHC-Ⅰ介導的抗原遞呈途徑的不同蛋白(抗原遞呈通路分子和MHC-Ⅰ)的磷酸化，可能影響細胞表面MHC-Ⅰ的表達和抗原遞呈。本團隊最近研究也發現，US3抑制PRV變異株感染豬睪丸(swine testis，ST)細胞早期MHC-Ⅰ的mRNA轉錄[13]。以上結果表明，US3對特異性免疫和非特異性免疫均有抑制作用，這在一定程度上解釋了US3缺失降低PRV對宿主的致病性。

3 US3抑制病毒介導的細胞凋亡

細胞凋亡是細胞的一種自我保護機制，是清除體內感染細胞的一種程序化反應，可限制病毒的復制和傳播。US3是PRV中唯一具有抗凋亡活性的基因。PRV US3基因編碼的兩種蛋白亞型(US3a、US3b)，均可抑制PRV引起的細胞凋亡。Geenen等[19]研究表明，PRV感染可誘導細胞凋亡，US3a和US3b可在病毒復制晚期抑制PRV引起的細胞凋亡，亦可抑制山梨醇等外源誘導凋亡劑引起的細胞凋亡。相較于US3b，US3a抗凋亡效率更高。另有研究發現，US3基因編碼的激酶活性，通過激活Bad蛋白磷酸化或PI3-K/AKT和NF-κB途徑抑制PRV感染細胞凋亡[20-21]。以上研究表明，US3抑制病毒介導的細胞凋亡依賴于其激酶活性，然而US3基因編碼的蛋白激酶對于PRV與宿主相互作用的調節方式和過程還需進一步研究。

4 US3影響病毒粒子在核質中的運輸

由于US3編碼蛋白分子較大，超過了被動擴散的限制，所以US3主要通過主動運輸穿梭于細胞核質之間，US3基因突變影響PRV在核質中的運輸[22-23]。Wagenaar等[24]研究發現，US3基因突變株在核膜外的跨膜轉運功能受損，病毒核衣殼初始物在核膜周圍聚集，核衣殼的進一步包裹和成熟受到影響，此研究表明US3參與病毒粒子向核外傳遞的過程。最近研究表明，US3a失活不影響病毒復制，US3b和US3編碼的完整激酶活性影響病毒粒子向核外傳遞[25-27]。通過qPCR檢測發現，與野毒株相比，US3缺失株DNA到達細胞核的效率顯著下降，表明US3在將病毒基因組傳遞到細胞核的過程中發揮了重要作用[28]。

5 US3協助PRV通過呼吸道基底膜

基底膜位于上皮細胞和固有層之間，是不同α皰疹病毒早期需要穿透的重要屏障[29-32]。研究表明，US3編碼蛋白在PRV侵入基底膜過程中發揮關鍵作用，通過研究豬鼻呼吸黏膜的離體系統發現，相比于親本毒株，US3基因缺失株在黏膜上皮中的擴散減少，且無法破壞基底膜。添加RhoA信號通路抑制劑可促進US3基因缺失株穿過基底膜，而對野毒株和復蘇株穿過效率無顯著影響，表明US3通過Rho-GTPase信號通路介導PRV通過基底膜，進而增強病毒在細胞間的傳播[25]。

6 US3介導細胞骨架重組

肌動蛋白是構成細胞骨架的重要部分，肌動蛋白損傷可增加病毒感染。研究表明多種皰疹病毒(包括PRV)可破壞細胞中的肌動蛋白。一些保守的α皰疹病毒US3能引起細胞肌動蛋白骨架發生變化，其中肌動蛋白應力纖維的斷裂和突起的形成都可增加病毒的傳播。皰疹病毒US3可在細胞核和細胞質中來回穿梭，致使US3基因編碼蛋白既能單獨識別細胞核或細胞質中的底物，又能識別在細胞核質中移動的底物，進而介導US3調控細胞骨架重排[33]。研究發現，PRV野生毒株和US3基因缺失株感染后，細胞內的肌動蛋白水平存在顯著差異[18]。此外，US3基因缺失株及激酶失活的US3突變株隨著病毒濃度的增加，肌動蛋白水平無顯著差異，此研究提示，US3可能導致感染細胞中肌動蛋白的分解。在SK-6細胞上接種PRV野生毒株和US3缺失株后，野生毒株感染細胞后肌動蛋白應力纖維的分解水平顯著高于US3缺失株，表明PRV US3基因編碼的蛋白參與感染細胞肌動蛋白應力纖維的分解[26]。

在Rho-GTPase信號通路中，RhoA、Rac1和Cdc42參與可調節肌動蛋白細胞骨架。RhoA GTPase的激活，可以介導肌動蛋白應力纖維的形成，Rac1 GTPase和Cdc42 GTPase與細胞突起的形成有關，Rac1/Cdc42 GTPase信號通路與RhoA GTPase信號相互拮抗。US3編碼蛋白的表達導致RhoA 188位絲氨酸磷酸化從而抑制了RhoA活性，引起細胞骨架的重組，非磷酸化RhoA突變體的表達，干擾US3誘導細胞骨架的重組。細胞蛋白激酶A被抑制后，US3編碼蛋白誘導RhoA188位絲氨酸磷酸化的作用減弱，表明US3編碼的蛋白，通過細胞蛋白激酶A依賴的RhoA 188位絲氨酸磷酸化，介導細胞骨架重組[27-28]。

Cofilin屬于ADE(actin depolymeriz-ing factor)蛋白家族，是肌動蛋白動力學中的核心分子，通過3位絲氨酸殘基的去磷酸化和磷酸化，調控肌動蛋白動力學。US3可通過誘導Cofilin蛋白去磷酸化引起細胞肌動蛋白骨架重組[34]。研究發現野生毒株和US3基因拯救毒株感染ST細胞，導致Cofilin 3位絲氨酸殘基磷酸化降低，而PRV US3缺失株與陰性對照相比，細胞中Cofilin 3位絲氨酸殘基磷酸化水平反而有增加的趨勢(無顯著差異)，表明US3可抑制Cofilin的磷酸化。US3編碼的蛋白激酶失活的PRV毒株，沒有抑制細胞內的Cofilin水平，表明抑制Cofilin的磷酸化依賴于US3編碼的激酶活性[35]。

以上研究表明，PRV US3基因編碼的激酶介導細胞骨架重組，進而增加病毒擴散，這種擴散方式可為PRV病毒感染所引起的疾病的預防與治療提供新的思路，然而具體的分子機制需要進一步研究。

7 結論

US3編碼的蛋白在PRV感染宿主過程中發揮著重要作用。US3編碼的蛋白可介導肌動蛋白骨架的重排及誘導宿主細胞形態改變，從而增強病毒在細胞間的傳播，亦可在病毒神經感染中和跨膜轉運中影響病毒的毒力，同時可抑制細胞凋亡及引起宿主免疫抑制，為病毒的復制提供了條件。PRV US3編碼的兩個蛋白亞型(US3a、US3b)均可抑制病毒介導的細胞凋亡，但由于二者在細胞中定位的不同導致其抑制凋亡的效率存在差異。US3介導MHC-Ⅰ下調是細胞依賴性的，具體的作用機制需要進一步研究。此外，US3編碼的蛋白激酶可介導宿主細胞肌動蛋白骨架的重排，影響病毒粒子在核質中的運輸。將來的研究還需明確US3a、US3b和US3編碼的蛋白激酶所介導的其他功能。本綜述為PRV的致病機制的研究提供了參考，同時為PRV基因缺失疫苗構建提供了新的缺失靶點。